福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究

 【目的】利用气相色谱技术检测福建省的40株青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株细胞内的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多态性；研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与青枯雷尔氏菌现有种下分化方法之间的关系。【方法】对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行气相色谱分析，比较同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌脂肪酸的分布；对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行聚类分析，分析聚成的各类青枯雷尔氏菌脂肪酸的特点以及脂肪酸多态性与其生理小种、生化型和致病性之间的关系。【结果】同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌，其脂肪酸都存在着明显的多态性；对40株青枯雷尔氏菌的脂肪酸进行聚类分析，可以聚成3类，即group Ⅰ、group Ⅱ和group Ⅲ；青枯雷尔氏菌生理小种1存在着不同的脂肪酸类群，青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生化型之间不存在相关性，但是脂肪酸和致病性之间存在一定的相关性：group Ⅰ为无致病性菌株，group Ⅱ为过渡性菌株，group Ⅲ为强致病性菌株。【结论】福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸分布存在着明显的多态性；青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在一定的相关性，脂肪酸有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标。     

青枯雷尔氏菌脂肪酸型与致病性的关系

 【目的】分析青枯雷尔氏菌脂肪酸种类变化与致病性指标-弱化指数和回接发病率的相互关系,提出青枯雷尔氏菌脂肪酸型种下分化的分类方法。【方法】青枯雷尔氏菌脂肪酸型分为：脂肪酸Ⅰ型,弱化指数＞0.8,回接发病率0%,属无致病力型;脂肪酸Ⅱ型,弱化指数为0.6～0.8,回接发病率为6.7%～100%,属过渡型,脂肪酸Ⅲ型,弱化指数＜0.6,回接发病率100%,属强致病力型。利用聚类分析、主成分分析、判别分析,分层筛选与脂肪酸型有关的脂肪酸种类.【结果】筛选出十四碳脂肪酸（X1）、十七碳脂肪酸（X9）,十八碳脂肪酸（X13）为主要因子,组建数据矩阵,建立脂肪酸型判别模型：Y1=-16.3353 + 0.0012X1 + 0.0056X9 - 0.0016X13,Y2= -3.4928 + 0.0002X1 + 0.0003X9 + 0.0025X13,Y3= -9.1550 - 0.0003X1 + 0.0039X9 + 0.0042X13,对于一个未知脂肪酸型的青枯雷尔氏菌菌株,首先测定脂肪酸图谱,取出X1（十四碳脂肪酸）、X9（十七碳脂肪酸）、X13（十八碳脂肪酸）,代入方程,计算Yi,当1≤Yi≤2时,归为脂肪酸型Ⅰ,当2≤Yi≤3时,归为脂肪酸型Ⅱ,当Yi＞3时,归为脂肪酸型Ⅲ,模型的判别准确率达90.00%。【结论】青枯雷尔氏菌脂肪酸型的研究,为其种下分化建模的标准化和计算机自动分析方法的建立,提供可靠的基础。脂肪酸型的模型建立也为其他植物病原菌的致病性研究提供了思路和方法。     

青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法的研究

采用不同浓度的强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91处理番茄盆栽苗,建立青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法.结合菌落形态和特异性引物鉴定结果说明所分离得到的菌株均为强致病力青枯雷尔氏菌.当番茄植株培养至第5d时,4个不同接种浓度处理的番茄植株苗均出现发病症状.采用104 cfu·mL-1处理的番茄植株在第4d发病,但到第8d,...     

青枯雷尔氏菌致病性的代谢组学异质性研究

采用基于LC/Q-TOF MS的代谢组学方法,对不同致病性青枯雷尔氏菌的胞外代谢物进行了分析,获得了具有显著性差异的代谢标志物,并采用PCA数据处理方法对不同致病性菌株进行分类,建立致病性的PLS-DA预测模型。结果表明,该方法可以从代谢水平上区分野生型强致病力菌株、野生型无致病力菌株以及强致病力菌株经Tn-5转座子插入导致致病力丧失的人工致弱突变菌株。对代谢标志物的差异分析结果表明,在无致病力菌株和Tn-5致弱菌株中,有12种代谢标志物与强致病力菌株具有显著性差异(P<0.05,FC≥2),并表现出相同的丰度变化趋势,预示着这些代谢标志物可能与青枯雷尔氏菌的致病性有关。     

拮抗青枯雷尔氏菌的放线菌筛选及其防病作用

【目的】青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是烟草的主要病害。本研究从不同生境的土壤中筛选出对青枯雷尔氏菌有较强拮抗作用的放线菌,探究其对青枯雷尔氏菌的生理特征影响以及对烟草青枯病的防治效果,为进一步开发防病微生物菌剂提供理论依据。【方法】利用共培养法和牛津杯法筛出目标放线菌后,通过形态学研究、生理生化试验和多基因系统发育分析对目标菌株进行菌种鉴定。通过96孔板法测定目标放线菌粗浸膏对青枯雷尔氏菌的最低抑菌浓度(MIC)。粗浸膏对青枯雷尔氏菌处理后,检测青枯雷尔氏菌的生长动态变化,并用扫描电子显微镜观察其形态的变化;通过测定β-半乳糖苷酶活性和碘化丙啶(PI)荧光试验以及傅里叶变换红外光谱观察对细胞膜通透性和膜成分的影响;通过测定胞外多糖(EPS)、胞内活性氧(ROS)等探究目标放线菌株对青枯雷尔氏菌的影响。并通过盆栽试验测定目标放线菌株对烟草青枯病的防治效果。【结果】根据形态特征、生理生化试验结果和测序结果,将筛选得到的目标放线菌Sa-21菌株鉴定为雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus),对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径达47...     

不同致病性青枯雷尔氏菌诱导番茄代谢产物的异质性研究

采用基于气相色谱-质谱联用技术的代谢组学方法 ,研究不同致病性青枯雷尔氏菌诱导番茄植株代谢物变化的异质性。将青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91和无致病力菌株FJAT-1458分别单独接种和混合接种番茄植株,以清水为对照,接种后6、24、48、72、96h取样,测定番茄植株代谢产物的变化。结果表明,检测到的代谢物种类主要为醇类、酯类、酸类、醛类、吡啶类和烷烃类。不同处理番茄代谢产物组成变化的时间动态结果表明,FJAT-91单独接种处理48h、FJAT-1458单独接种处理48h、同时接种FJAT-91和FJAT-1458处理96h及对照处理72、96h的番茄中检测到代谢物种类最多,分别为12、18、15和15种。邻苯二甲酸二丁酯在不同处理不同时间的番茄中均检测到,为完全分布类型,其他代谢物为不完全分布类型。FJAT-91单独接种处理能诱导番茄代谢产物棕榈酸消亡,而FJAT-1458单独接种或与菌株FJAT-91混合接种及对照处理的番茄植株该代谢物维持在相当含量,说明该代谢物可能与植株免疫抗病有关。主成分分析表明,不同接种处理诱导番茄植株的代谢谱存在一定的差异,主成分一和主成分二基本上能将其区分开来。     

抗烟草青枯病菌的枯草芽孢杆菌SH7的筛选与鉴定

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的烟草青枯病是我国烟区的主要病害之一,严重影响烟草的产量和品质。从云南和贵州烟草青枯病重病区采集600份健康烟草根基土壤,并从中筛选出1株对R. solanacearum具有较强拮抗活性的细菌菌株SH7,该菌株在室内平板抑菌试验中,对R. solanacearum抑菌带宽可达132 mm。预先用SH7无菌发酵液保护烟株根部,对R. solanacearum防效达到66.0％。SH7发酵液经70％(NH4)2SO4饱和度沉淀并透析后得到的蛋白粗提液经平板抑菌活性检测,对R. solanacearum具有很强的抑菌活性,抑菌带宽为157 mm。初步确定SH7菌株产生的主要抑菌活性物质为蛋白多肽类物质。经菌体形态学、生理生化测定和16s rDNA序列测定,结果表明:SH7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

茄子3株内生细菌分别与青枯雷尔氏菌混合培养特性研究

采用混合培养的方法,研究3株茄子内生细菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,FJAT-943)、血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanguinis,FJAT-946)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus,FJAT-964)与青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,FJAT-1305)数量消长动态。筛选优化培养基配方为:葡萄糖5g.L-1,酵母膏5g.L-1,蛋白胨10g.L-1。混合培养条件下,各菌株生长数量均低于单独培养。菌株FJAT-943和菌株FJAT-1305混合培养体系中,菌株FJAT-1305不能生长;菌株FJAT-946与菌株FJAT-1305混合培养3d,菌株FJAT-1305生长数量为7.40×109 cfu.mL-1,显著低于单独培养的9.78×109 cfu.mL-1;菌株FJAT-964与菌株FJAT-1305混合体系中,生长数量与单独培养均无显著差异。菌株FJAT-943、FJAT-946对菌株FJAT-1305具有显著抑制作用。     

青枯雷尔氏菌在芝麻植株内的分布及消长动态

芝麻青枯病是我国南方芝麻生产上的重要土传病害。通过测定健康植株、不同发病时期的自然病株及人工接种病株内不同部位青枯雷尔氏菌数量,旨在明确病菌在芝麻植株内的分布及消长动态。结果表明:发病初期,病株内青枯雷尔氏菌总数量随着病情的发展而增加,之后随着病情严重度的加重而下降。病菌的致病力则随着病情发展呈现持续上升的趋势。检测的所有芝麻健株各部位均无青枯雷尔氏菌分布,说明芝麻植株不存在无症状侵染现象。青枯雷尔氏菌在芝麻病株内的分布呈现丰富的多态性,自然病圃和灌根接种的Ⅱ类、Ⅲ类病株各部位菌量分布随着植株高度的升高而递减,但其Ⅰ类病株中下部菌量却高于基部。针刺接种的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类病株,接种点以下的根部和基部均有青枯雷尔氏菌分布,说明青枯雷尔氏菌不仅可随植物蒸腾向上扩散,也可向下蔓延。     

转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性

【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行gfp/luxAB基因双标记,研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化,采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同,均为长椭圆形,近杆状,整个细胞呈现绿色荧光,PCR结果表明,从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期,荧光素酶活性快速增加,到稳定期,荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次,仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光,荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致,在番茄组培苗内的侵染路线相同,致病力均达到90%以上。【结论】将gfp和luxAB融合基因成功转入青枯雷尔氏菌,融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。     

抗姜瘟病菌芽孢杆菌的诱变改良

为改良拮抗姜瘟病菌的芽孢杆菌,从未发病土壤分离得到1株对茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)等8种病原菌具有较强拮抗能力的蜡状芽孢杆菌菌株L1.为进一步改进该菌的拮抗活性,采用紫外线(UV)、甲基磺酸乙酯(EMS)、吖啶橙等诱变因素对L1菌株进行诱变改良.结果表明:改良后菌株的拮抗性能显著提高,其中菌株EMS-2和UL-1的拮抗蛋白浓度分别比L1菌株提高30.38%和29.18%,其差异均达极显著水平;L1对UV照射十分敏感,尤其在前60 s,而90 s的照射处理正突变率最高,达24.8%;吖啶橙处理L1后,没有筛选到发生正突变的菌株;L1在EMS处理80 min后,致死率达到90%左右,因此,为大量获取正突变菌株,应采用较低剂量的EMS(0.16 mol?mL-1)、长时间处理程序(60 min为宜).     

姜瘟病菌生防芽孢杆菌蛋白的分离及其生物活性

姜瘟病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种细菌性病害,是世界生姜产区中普遍发生的一种毁灭性土传病害。研究表明,从发病田中未发病植株的根际土壤中分离得到的蜡状芽孢杆菌菌株L1(B.cere-us,L1)对茄科雷尔氏菌等8种病原菌具有较强的拮抗能力,具有广谱抗性。经Econo-Pac Q离子交换柱纯化、SDS-PAGE分析,从菌株L1得到一个表观分子量约为40 kDa的拮抗蛋白Lp,该蛋白具有光稳定性,在pH 6.0~8.0,温度20~60℃条件下均表现出对茄科雷尔氏菌的极强拮抗能力,但经胰蛋白酶处理后失活。实验表明,0.38 mg/mL为该蛋白的最低拮抗浓度。     

芽孢杆菌在促进番茄生长和控制青枯病上的比较优势

在离体条件下对47个芽孢杆菌分离物进行了抑制番茄青枯病菌测定,其中12个表现良好的抑菌能力,通过细菌学和Biolog分析将其中5个代表性拮抗菌分别鉴定为枯草芽孢杆菌,解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌,其中枯草芽孢杆菌菌株的抑菌能力最强,解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌株其次.同时在温室条件下测定这5个芽孢杆菌拮抗菌促进番茄生长和诱导番茄对青枯病的抗性效果.用芽孢杆菌处理番茄种子能够有效地控制番茄青枯病,通过测定种子萌发,植株生长高度以及鲜重和干重表明芽孢杆菌的大多数分离物能够促进植物生长,同时这5个芽孢杆菌拮抗菌比对照显著地减少了青枯病的发病率,然而, 促生和病害抑制的效果因不同的菌株而异.其中枯草芽孢杆菌拮抗菌株不仅是良好的促生剂,也是有效的抗性诱导剂,它能减少青枯病80%,充分显示了芽孢杆菌在番茄青枯病治理上的潜在重要性.     

芽孢杆菌在促进番茄生长和控制青枯病上的比较优势

在离体条件下对47个芽孢杆菌分离物进行了抑制番茄青枯病菌测定,其中12个表现良好的抑菌能力,通过细菌学和Biolog分析将其中5个代表性拮抗菌分别鉴定为枯草芽孢杆菌,解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌,其中枯草芽孢杆菌菌株的抑菌能力最强,解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌株其次.同时在温室条件下测定这5个芽孢杆菌拮抗菌促进番茄生长和诱导番茄对青枯病的抗性效果.用芽孢杆菌处理番茄种子能够有效地控制番茄青枯病,通过测定种子萌发,植株生长高度以及鲜重和干重表明芽孢杆菌的大多数分离物能够促进植物生长,同时这5个芽孢杆菌拮抗菌比对照显著地减少了青枯病的发病率,然而, 促生和病害抑制的效果因不同的菌株而异.其中枯草芽孢杆菌拮抗菌株不仅是良好的促生剂,也是有效的抗性诱导剂,它能减少青枯病80%,充分显示了芽孢杆菌在番茄青枯病治理上的潜在重要性.     

节杆菌YB6发酵滤液稳定性测定及其对盆栽番茄青枯病的防治效果

节杆菌YB6 (Arthrobacter spp.)为番茄青枯病拮抗菌株,其发酵滤液稳定性测定结果表明,该发酵滤液对热、酸碱及蛋白酶K敏感,在60益及其以上温度失去抑菌活性;强酸强碱条件和蛋白酶K浓度1.5 mg/mL以上均会使其活性显著下降;对光照和紫外线稳定,5 h紫外线照射和35 000 lx光照条件下抑菌活性无显著变化。抗菌谱研究显示,对测试的8种病原菌均有抑制效果,其中对甘蔗黑粉病和小麦赤霉病抑制效果较强,抑菌率分别达88.6%和80.2%。以蘸根对番茄青枯病的防效最好,其防治率达到65.0%。     

植物病原细菌(Ralstonia solanacearum)染色体基因组分泌信号肽计算机分析

应用SignalP3．0、TMHMM2．0、THUMBUP、big—PI、TargetP1．01、Lipop1．0、TatP1．0等7种软件对植物病原细菌Ralstonla solanacearumGMI1000染色体基因组3448个氨基酸序列进行预测分析。结果表明,该物种染色体基因组分泌信号肽ORFs有178个,占其基因组编码ORFs的5．2％,其中有150个ORFs属于I型分泌信号肽,28个ORFs属于Ⅱ型分泌信号肽。在178个ORFs中具RR—motif信号肽结构的有13个,其中11个属于I型信号肽,2个属于Ⅱ型信号肽。通过软件预测未发现Comc型信号肽与细菌素-信息素型信号肽结构。在染色体分泌信号肽ORFs中,有116个具可预测功能,其余62个为功能未知的推定蛋白。已知功能主要集中于细胞代谢、细胞调控及转运、细胞膜结构等领域,这些功能是该物种在长期进化过程中与环境中各种因子发生互作,相互适应的结果。     

抗烟草青枯病拮抗菌的筛选及抑菌活性研究

[目的]为了筛选能有效防治烟草青枯病的生防菌株。[方法]对从土壤中分离到的链霉菌产生的次生代谢产物的抑菌活性和理化性质采用管碟法进行了测定。[结果]离体条件下,发酵液具有耐热性,在100℃以下仍具有较强的抑菌活性。在一定的pH值范围内(pH值3.8～9.0),拮抗能力无明显差异,其中在接近中性条件下拮抗活性较强。拮抗物质经胰蛋白酶处理后,拮抗活性亦无明显变化。经终浓度为2 mol/L(NH4)2SO4处理过的粗发酵液,其上清液与沉淀均具有拮抗活性,沉淀经SDS-PAGE凝胶电泳检测证明其拮抗物质具有蛋白质性质。[结论]1#链霉菌具有很好的开发研究价值。     

青枯雷尔氏菌在植株体内分布及其致病力的异质性研究

 【目的】通过分析青枯雷尔氏菌在不同寄主发病植株、在同一寄主不同侵染状态植株和同一寄主不同发病阶段植株体内分布及其致病力的异质性，从生态位角度来初步探讨该病原菌与植物之间的相互关系。【方法】采用田间采样，室内测定样本的含菌量及其病原菌的致病性（弱化指数），统计分析比较青枯雷尔氏菌在寄主植株体内的分布和致病力的异质性。【结果】番茄和茄子病株体内青枯雷尔氏菌的平均含菌量>100×108 cfu/g，显著高于烟草、花生和生姜（<70×108 cfu/g）。青枯雷尔氏菌的分布在番茄体内依次为根部>中部以上茎>中部以下茎；茄子和花生从根到上部茎依次含菌量逐渐降低；烟草根部和中部茎的含菌量显著高于下部和上部茎；生姜下部茎的含菌量显著高于姜块和中上部茎。不同寄主植物植株体内青枯雷尔氏菌的致病性差异显著，根据弱化指数的划分标准，平均弱化指数的大小依次为茄子>烟草>花生>番茄>生姜；生姜体内的青枯雷尔氏菌的平均弱化指数为0.49（<0.60），明显表现为强致病力，茄子体内的为0.80，接近于无致病力，烟草、花生和番茄为0.64～0.70，属于致病力不确定的菌株。茄子、生姜和花生的健康和发病植株检测的结果表明，仅有花生的健康与发病植株同时存在着青枯雷尔氏菌，而茄子和生姜健株无青枯雷尔氏菌侵染。【结论】青枯雷尔氏菌在不同寄主、不同发病状态、不同生育期植株体内的分布及致病力呈现明显的生态位分化的特征，了解这一特性对于青枯雷尔氏菌控制具有重要意义。