不同致病力青枯雷尔氏菌诱导番茄防御相关信号途径基因的表达分析

[目的]探究不同致病力青枯雷尔氏菌诱导番茄防御相关基因的表达水平,为探明无致病力青枯雷尔氏菌的生防机制奠定基础.[方法]以无菌水为对照(CK),分别接种青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT91和无致病力菌株FJAT1458,接种后不同时间(0,3,6,12,24,36,48,72 h)取样,利用荧光定量PCR技术,检测接种...     

拮抗青枯雷尔氏菌的放线菌筛选及其防病作用

【目的】青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是烟草的主要病害。本研究从不同生境的土壤中筛选出对青枯雷尔氏菌有较强拮抗作用的放线菌,探究其对青枯雷尔氏菌的生理特征影响以及对烟草青枯病的防治效果,为进一步开发防病微生物菌剂提供理论依据。【方法】利用共培养法和牛津杯法筛出目标放线菌后,通过形态学研究、生理生化试验和多基因系统发育分析对目标菌株进行菌种鉴定。通过96孔板法测定目标放线菌粗浸膏对青枯雷尔氏菌的最低抑菌浓度(MIC)。粗浸膏对青枯雷尔氏菌处理后,检测青枯雷尔氏菌的生长动态变化,并用扫描电子显微镜观察其形态的变化;通过测定β-半乳糖苷酶活性和碘化丙啶(PI)荧光试验以及傅里叶变换红外光谱观察对细胞膜通透性和膜成分的影响;通过测定胞外多糖(EPS)、胞内活性氧(ROS)等探究目标放线菌株对青枯雷尔氏菌的影响。并通过盆栽试验测定目标放线菌株对烟草青枯病的防治效果。【结果】根据形态特征、生理生化试验结果和测序结果,将筛选得到的目标放线菌Sa-21菌株鉴定为雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus),对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径达47...     

福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究

 【目的】利用气相色谱技术检测福建省的40株青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株细胞内的脂肪酸，分析其脂肪酸分布的多态性；研究青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与青枯雷尔氏菌现有种下分化方法之间的关系。【方法】对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行气相色谱分析，比较同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌脂肪酸的分布；对40株青枯雷尔氏菌脂肪酸进行聚类分析，分析聚成的各类青枯雷尔氏菌脂肪酸的特点以及脂肪酸多态性与其生理小种、生化型和致病性之间的关系。【结果】同一寄主分离的青枯雷尔氏菌和不同寄主分离的青枯雷尔氏菌，其脂肪酸都存在着明显的多态性；对40株青枯雷尔氏菌的脂肪酸进行聚类分析，可以聚成3类，即group Ⅰ、group Ⅱ和group Ⅲ；青枯雷尔氏菌生理小种1存在着不同的脂肪酸类群，青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与其生化型之间不存在相关性，但是脂肪酸和致病性之间存在一定的相关性：group Ⅰ为无致病性菌株，group Ⅱ为过渡性菌株，group Ⅲ为强致病性菌株。【结论】福建省青枯雷尔氏菌脂肪酸分布存在着明显的多态性；青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性与致病性之间存在一定的相关性，脂肪酸有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标。     

1株烟草青枯病拮抗内生细菌的分离及鉴定

为了筛选具有生防价值的拮抗烟草青枯雷尔氏菌的内生细菌,从湖南长沙、永州、郴州烟草青枯病发病区的健康烟株采集茎秆,采用稀释平板分离法获得150个内生菌株.抑菌结果表明,21个内生菌株对烟草青枯雷尔氏菌2316菌株有拮抗效果,占总菌株数的14.0％.拮抗菌株中,F1菌株24 h对烟草青枯雷尔氏菌株2316抑菌圈直径达6.5...     

芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究

将采自江西12个县(市)的芝麻青枯雷尔氏菌29株菌株分别人工接种到寄主植物番茄、茄子、马铃薯和烟草上,鉴定结果表明:全部菌株属于生理小种1;25株菌株属生化变种Ⅲ,3株属生化变种Ⅳ,1株为生化变种Ⅲ-1亚种。对致病力测定结果的聚类分析表明:来自进贤、都昌、南昌、樟树4个红壤旱地传统种植区的菌株致病力最强;来自鄱阳砂壤及潮洲地传统种植区的菌株致病力中等;来自其它6个区域的菌株致病力最弱。因此,江西芝麻青枯雷尔氏菌的致病力存在明显的分化现象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生态是影响青枯雷尔氏菌致病力分化的重要因子。     

芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究

将采自江西12个县(市)的芝麻青枯雷尔氏菌29株菌株分别人工接种到寄主植物番茄、茄子、马铃薯和烟草上,鉴定结果表明:全部菌株属于生理小种1;25株菌株属生化变种Ⅲ,3株属生化变种Ⅳ,1株为生化变种Ⅲ-1亚种。对致病力测定结果的聚类分析表明:来自进贤、都昌、南昌、樟树4个红壤旱地传统种植区的菌株致病力最强;来自鄱阳砂壤及潮洲地传统种植区的菌株致病力中等;来自其它6个区域的菌株致病力最弱。因此,江西芝麻青枯雷尔氏菌的致病力存在明显的分化现象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生态是影响青枯雷尔氏菌致病力分化的重要因子。     

青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法的研究

采用不同浓度的强致病力青枯雷尔氏菌FJAT-91处理番茄盆栽苗,建立青枯雷尔氏菌致病性生物测定方法.结合菌落形态和特异性引物鉴定结果说明所分离得到的菌株均为强致病力青枯雷尔氏菌.当番茄植株培养至第5d时,4个不同接种浓度处理的番茄植株苗均出现发病症状.采用104 cfu·mL-1处理的番茄植株在第4d发病,但到第8d,...     

转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性

【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行gfp/luxAB基因双标记,研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化,采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同,均为长椭圆形,近杆状,整个细胞呈现绿色荧光,PCR结果表明,从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期,荧光素酶活性快速增加,到稳定期,荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次,仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光,荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致,在番茄组培苗内的侵染路线相同,致病力均达到90%以上。【结论】将gfp和luxAB融合基因成功转入青枯雷尔氏菌,融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。     

青枯雷尔氏菌在植株体内分布及其致病力的异质性研究

 【目的】通过分析青枯雷尔氏菌在不同寄主发病植株、在同一寄主不同侵染状态植株和同一寄主不同发病阶段植株体内分布及其致病力的异质性，从生态位角度来初步探讨该病原菌与植物之间的相互关系。【方法】采用田间采样，室内测定样本的含菌量及其病原菌的致病性（弱化指数），统计分析比较青枯雷尔氏菌在寄主植株体内的分布和致病力的异质性。【结果】番茄和茄子病株体内青枯雷尔氏菌的平均含菌量>100×108 cfu/g，显著高于烟草、花生和生姜（<70×108 cfu/g）。青枯雷尔氏菌的分布在番茄体内依次为根部>中部以上茎>中部以下茎；茄子和花生从根到上部茎依次含菌量逐渐降低；烟草根部和中部茎的含菌量显著高于下部和上部茎；生姜下部茎的含菌量显著高于姜块和中上部茎。不同寄主植物植株体内青枯雷尔氏菌的致病性差异显著，根据弱化指数的划分标准，平均弱化指数的大小依次为茄子>烟草>花生>番茄>生姜；生姜体内的青枯雷尔氏菌的平均弱化指数为0.49（<0.60），明显表现为强致病力，茄子体内的为0.80，接近于无致病力，烟草、花生和番茄为0.64～0.70，属于致病力不确定的菌株。茄子、生姜和花生的健康和发病植株检测的结果表明，仅有花生的健康与发病植株同时存在着青枯雷尔氏菌，而茄子和生姜健株无青枯雷尔氏菌侵染。【结论】青枯雷尔氏菌在不同寄主、不同发病状态、不同生育期植株体内的分布及致病力呈现明显的生态位分化的特征，了解这一特性对于青枯雷尔氏菌控制具有重要意义。     

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株的异质性

【目的】研究青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）Tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标“弱化指数（attenuation index,AI）”和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株进行致病力测定;利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性;构建色谱效价指数（chromatography titer index, CTI_i）,CTI_i=S_i/（S₁+S₂+S₃）×100%（i=1、2或3;S₁、S₂和S₃分别对应P₁、P₂和P₃的峰面积）,测定不同致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的CTI_i值,用皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient,PCC）分析色谱效价指数与突变菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互关系。【结果】基于AI值和生物测定结果,青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种不同致病力类型：强致病力、无致病力和中间型。强致病力菌株共33株,其AI值介于0.49-0.63,接种番茄15 d,植株发病率为66.33%-100%;无致病力菌株共有20株,其AI值介于0.78-0.89,接种番茄15 d,植株发病率为0;中间型菌株共有7株,其AI值介于0.68-0.73,接种番茄15 d,植株发病率为24.17%-45.92%。20株无致病力突变菌株对番茄青枯病的防治效果测定结果显示,防治效果介于16.68%-92.45%,菌株T831防治效果最好,达91.74%,其次是菌株T780,防治效果为87.51%,菌株T497防治效果最差,为16.68%。不同致病力青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱分离结果显示,青枯雷尔氏菌经高效离子交换色谱可以分离出P₁（出峰时间为0.6 min）、P₂（出峰时间为4.4或4.5 min）和P₃峰（出峰时间为5.9或6.0 min）;强致病力菌株和无致病力菌株均具有3种不同峰类型：单峰、双峰和3个峰,强致病力菌株的主峰为P₃峰,无致病力菌株的主峰为P₁峰,中间型菌株有双峰和3个色谱峰两种类型;强致病力菌株中CTI₃为100%的菌株,致病力最强,诱导番茄植株发病率均达85%以上,CTI₃＜100%的菌株,接种后番茄植株发病率介于66.33%-84.14%;无致病力菌株中CTI₁达100%的菌株,其防治效果高,均达到80%以上,CTI₁＜90%的菌株,其防治效果低,介于16.68%-63.62%;CTI₃与突变菌株致病力呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.62;CTI₁与无致病力突变菌株的防治效果呈极显著正相关,相关系数PCC值为0.80。【结论】青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种致病力类型,不同致病力菌株的色谱行为不同。构建的色谱效价指数CTI₁可用于快速筛选出无致病力高效生防菌株,CTI₃可作为青枯雷尔氏菌致病力的参考指标。     

苏云金杆菌低成本固体发酵培养基的研制

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一类对多种害虫有效的病原微生物。为降低该菌产品制剂的生产成本,以北方常见的玉米芯粉、棉粕、豆粕等农产品下脚料为培养基质,研究了对多种鳞翅目、双翅目害虫具有特异杀虫活性的Bt菌株CYZ-4的固体发酵培养基配方。经对培养基的初始含水量、p H值等单因素试验发现,培养基初始含水量为70%、p H值为8.2时,玉米芯固体发酵培养基的产孢量达到最大;当玉米芯粉与棉粕质量比为5∶5和6∶4,与豆粕质量比为6∶4或7∶3时,发酵效果优于其他组合,产物孢子浓度在9.3×109个/g以上;复合固体发酵培养基基础配方中,玉米芯粉、棉粕、豆粕质量分数分别为19.1%、7.2%、3.6%时发酵Bt的效果最好。培养基3种成分及p H值的L9(34)正交试验结果表明,将玉米芯粉、豆粕、棉粕按质量分数分别为16.0%、6.7%、7.2%的比例混合,添加0.075%KH2PO4、0.05%Mg SO4、0.035%Ca CO3,调节初始含水量为70%、p H值为8.2,按4%的接种量接种,30℃下培养6 d,菌株的产孢量最大,达到1.80×1010个/g。该固体发酵培养基配方成本低,发酵条件简单,适于以药肥撒施毒土方式施用防治鳞翅目和双翅目地下害虫。     

基于响应面法的耐镉假单胞菌TCd-1培养条件优化

  目的  利用响应面法优化耐镉菌株假单胞菌Pseudomonas TCd-1的培养条件。  方法  以基础发酵培养条件为对照,菌株吸光度D(660)作为评价指标,利用单因素试验确定培养基组分的最佳碳源、氮源和无机盐种类,通过Plackett-Burman试验设计评价牛肉膏、酵母粉、氯化镁、培养温度、初始pH、接菌量、培养时间和转速8个因素对菌株生长的影响,进而确定显著影响因素,然后进行最陡爬坡试验获得显著影响因素的最优组合,结合Box-Behnken试验设计和响应面分析,优化假单胞菌TCd-1的培养条件。  结果  菌株培养基组分的最佳碳源、氮源和无机盐分别为牛肉膏、酵母粉和氯化镁;影响菌株生长的显著性因素为酵母粉、培养温度、初始pH;基于响应面法优化后的培养条件为:牛肉膏质量分数为0.5%,酵母粉1.0%,氯化镁0.5%,pH 6.3,温度33 ℃,接菌量1.25%,转速160 r·min?1,培养时间24 h。  结论  根据最佳条件, 进行重复试验得到优化后的菌液吸光度D(660)比对照提高了67.07%,与模型预测值相一致,表明优化后的条件显著促进了菌株的生长,达到预期目的。图1表6参26     

产异淀粉酶嗜热菌选育及产酶条件的研究

以嗜热脂肪芽孢杆菌为初始菌种,经过诱变筛选,得到产异淀粉酶的突变菌株UM761,酶活在原始菌种产酶水平的基础上提高了2~3倍。对UM761的产酶条件进行了优化,结果表明:最适产酶菌株培养条件为以1%葡萄糖作为碳源,牛肉膏、蛋白胨和酵母粉的混合物作为氮源,温度44~46℃,培养时间48~64 h,培养基初始pH值6.2~6.5。金属离子Co2+、Mg2+、Ca2+对异淀粉酶有较强的激活作用,而Fe3+、Fe2+对酶则有较强的抑制作用。     

枯草芽孢杆菌H4培养条件的优化

以枯草芽孢杆菌H4为试验材料,利用Plackett-Burman设计法,对影响菌体生长的7个因素进行了筛选,确定影响该菌生长的主要因素为牛肉膏、转速、蛋白胨和NaCl;采用响应面分析法对其中3个重要因子的最佳水平进行研究。结果表明,当牛肉膏为8.635g/L,蛋白胨为13.737g/L,NaCl为5.345g/L,接种量6.25%,初始pH7,温度39℃,转速150r/min培养时,菌体密度显著提高,菌株H4的OD460值由0.899提高到了1.129。     

产β-半乳糖苷酶芽孢杆菌的筛选及产酶条件的优化

[目的]筛选产β-半乳糖苷酶的芽孢杆菌并对其产酶条件进行优化。[方法]从土壤中筛选出一株具有β-半乳糖苷酶活性的菌株,对其进行鉴定并对其发酵产酶条件进行优化。[结果]该菌株被初步鉴定为巨大芽孢杆菌。该菌株的最佳碳源是乳糖,最佳氮源是牛肉膏和蛋白胨,Na+对产酶有明显的促进作用。当乳糖含量为1.20%,牛肉膏含量为0.63%,蛋白胨含量为1.04%时,该菌株所产β-半乳糖苷酶酶活可达3.68 U/ml。初始pH值为8.0,培养温度为45℃,接种量为2%,振荡培养17 h,该菌株所产β-半乳糖苷酶的酶活最高,为5.49 U/ml。[结论]该菌株在高温条件下生长旺盛,适宜生长pH值范围广,在生产实践中具有一定的应用价值。     

苏云金芽孢杆菌发酵培养基的筛选

采用正交试验对BtWB7菌株发酵培养基进行筛选,结果表明,不同原料对发酵液菌数影响相差较大,其中酵母粉和鱼粉影响最大.本试验获得的最佳摇瓶发酵配方为:玉米粉4%、黄豆饼粉1%、酵母粉2%、鱼粉2.5%和蛋白胨0.1%(质量分数).     

一株产抗灰霉病菌株的发酵优化研究

[目的]对枯草芽孢杆菌a1发酵条件进行初步优化。[方法]以顺丁烯二酸酐为基础碳源,采用生长速率法测定发酵液对番茄灰霉菌的抑制率。[结果]该菌株较佳发酵条件为：酵母膏1%,含1%顺丁烯二酸酐的PDB培养基培养,温度30℃,接种量1%,装液量50 ml/500 ml,初始pH值5.5,摇床转速150 r/min,发酵时间120 h。[结论]为开发新型微生物源农药奠定基础。     

地衣芽孢杆菌生防菌株SDYT-79发酵条件优化

探讨地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDYT-79菌株液体发酵条件,为提高其活性次级代谢产物的产量提供技术支持。通过单因子试验和正交试验,对该菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行优化。结果表明:地衣芽孢杆菌SDYT-79菌株培养基各组分的最佳配比为:蔗糖3.0%、蛋白胨0.3%、酵母膏2.0%、氯化钠0.3%,最佳发酵培养条件为:初始pH值9.0、培养温度24℃、培养时间36h、250mL三角瓶装液量120mL、接种量体积分数0.5%~1%。在最佳发酵培养基和培养条件下,SDYT-79菌株抑菌能力提高14.3%。     

一株普鲁兰酶产生菌的分离鉴定及发酵条件的优化

普鲁兰酶是一类淀粉分支酶,在淀粉加工等行业有着广泛的应用。利用平板涂布法从淀粉加工厂附近土壤中分离到一株产普鲁兰酶的细菌H4,通过形态学、生理生化试验及16S rDNA分类鉴定,确定该细菌为一株微小杆菌(Exiguobacterium sp. H4)。对该菌株培养基成分及产酶条件进行了优化,即2%土豆淀粉,1%蛋白胨,0.5%牛肉膏,0.1% KH2PO4,0.05% MgSO4·7H2O和0.0001% FeSO4,初始pH 7.0,发酵温度37℃,摇床转数200 r/min,发酵72 h后胞外产生普鲁兰酶的活力可达6.35 U/mL,比复筛的产量3.02 U/mL提高了110.2%。     

枯草芽孢杆菌CG24发酵条件优化

 枯草芽孢杆菌CG24是一株烟草野火病菌拮抗菌,本文采用单因素实验和响应面法对该菌株发酵条件进行了优化。结果表明CG24菌株在培养温度32℃初始pH 7.5装液量50mL/150mL和接种量4%的NA培养液中振荡培养28h,其代谢产物的抑菌活性作用最为显著。通过单因素实验确定了影响菌株CG24生长的培养基主要因素为葡萄糖、酵母膏和氯化钙,对3个因素进行响应面优化分析,确定最优发酵培养基为：葡萄糖40g/L酵母膏7.55g/L氯化钙0.72g/L,抑菌圈直径比优化前提高了25.72%,为该菌株以后的扩大培养和微生态制剂的开发应用奠定了基础。