华东葡萄抗白粉病转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

以抗白粉病华东葡萄（Vitis pseudoreticulata W.T.Wang）株系白河-35-1为材料,在经葡萄白粉病病原菌（Uncinula necator（Schw.）Burr.）诱导后获得的EST序列的基础上,本研究通过RACE技术克隆了一个具有转录域的转录因子全长1324bpcDNA序列,其阅读框为1053bp,编码350个氨基酸,命名为VpRFL1（GenBank登录号：FJ356672）。应用PCR技术,进一步获得了转录因子VpRFL1基因的DNA序列,其序列全长1599bp,VpRFL1基因包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析表明,华东葡萄白河-35-1VpRFL1基因编码的氨基酸序列在N端含有核定位信号,C端含有C4C4型RING锌指结构域。VpRFL1/PBI221-GFP在洋葱（Alliumcepa）表皮细胞中的瞬时表达分析表明,该转录因子主要定位于细胞核内。VpRFL1的序列特征与定位分析结果初步表明该转录因子基因在核内起作用,并可能参与了抗逆反应的相关途径。     

中国野生葡萄芪合成酶基因融合表达、纯化及多克隆抗体制备

根据中国野生葡萄芪合成酶基因cDNA序列(该序列已申请国家发明专利,申请号:200510041662.4),设计1对PCR引物,以野生种华东葡萄(Vitispseudoreticulata)白河-35-15'RACEcDNA第一链为模板,克隆该目的基因。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化EscherichiacoliBL21,经诱导后表达出约66kD的融合蛋白。该融合蛋白主要以包涵体形式表达,经变性剂溶解、梯度透析,对该包涵体进行复性,复性蛋白通过与GlutathioneSepharose4BFastFlow结合、洗脱,获得了纯化的芪合成酶融合蛋白。以洗涤纯化的包涵体作抗原免疫家兔,制备多克隆抗血清,经Westernblot检测,该抗血清(稀释到1∶3000)与芪合成酶融合蛋白识别反应良好。     

葡萄β型液泡加工酶基因(VvβVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.     

山葡萄VaCIPK18原核表达与多克隆抗体制备

类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs)作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230～439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E.coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L^-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 k...     

水稻PDK2基因原核表达和多克隆抗体制备

本研究以水稻幼苗为材料,通过RT-PCR扩增得到1.1kb的编码PDK2(登录号:AK100033)基因的片段,成功构建重组表达载体pET-23d-PDK2并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。研究结果表明,重组蛋白以包涵体的形式存在,且PDK2的最佳表达条件为:28℃,120r/min,0.5mmol/L IPTG诱导60min。经纯化后免疫新西兰大白兔以制备PDK2多克隆抗体。Western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好,这为进一步研究水稻PDK2的生物学功能奠定了基础。     

猪转录因子Nanog高效表达、多克隆抗体制备及其应用

多能转录因子Nanog可维持干细胞的自我更新和多向分化潜能.为深入研究猪(Sus scrofa)Nanog在多能性调控网络的作用,本研究制备了鼠抗猪源Nanog多克隆抗体.首先,从猪肾脏中克隆Nanog基因CDS,再将CDS连接到pET32a质粒上,构建重组表达载体pET32a-Nanog.将重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,优化最佳诱导时间、温度和IPTG浓度等表达条件,获得分子量为57 kD的Nanog重组蛋白.将纯化的Nanog蛋白,免疫C57BL/6小鼠(Mus musculus),6周后获得阳性抗血清,通过Western blot和免疫荧光检测其抗体效价及其特异性.结果显示,在28℃、8 mmol/L IPTG、诱导2.5 h的条件下,可获得高效Nanog重组表达;制备的鼠抗猪Nanog多克隆抗体能特异性识别猪诱导多能干细胞表达的Nanog蛋白.研究结果为猪多能性干细胞的研究提供了有力工具.     

葡萄VvJAZ9蛋白原核表达与多克隆抗体制备

JAZ蛋白是茉莉酸(JA)信号调控途径中的重要组分,也是调节JA参与植物生长发育以及逆境应答的关键因子。JAZ9基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为研究欧洲葡萄VvJAZ9蛋白参与低温胁迫的功能,本试验以欧洲葡萄霞多丽叶片为研究材料,通过同源克隆获得了VvJAZ9基因序列,其全长807 bp,编码268个氨基酸,定位于第11条染色体,有5个外显子和4个内含子;VvJAZ9蛋白具有JAZs家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和CCT＿2结构域,与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明,VvJAZ9基因在低温处理1～24 h后表达量呈上升趋势,在24 h表达量最高。亚细胞定位结果证实VvJAZ9定位于细胞核。将VvJAZ9的开放阅读框(ORF)序列克隆至原核表达载体pET28b上,在大肠杆菌(E. coli BL21)中经37℃、1.0 mmol·L^-1异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvJAZ9-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备anti-VvJAZ9兔源多克隆抗体。蛋白...     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

潮霉素磷酸转移酶的原核表达纯化及其抗体制备

本研究从转基因玉米基因组上成功克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamHⅠ和Hind III 双酶切作用,将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接成功构建pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3) 菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了潮霉素磷酸转移酶（HPT）,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔子制备了特异性强的多克隆抗体。     

潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因的原核表达、蛋白纯化及其抗体制备

从转基因玉米(Zea mays)基因组上成功地克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接,成功构建了pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中进行蛋白表达.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了HPT蛋白,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白.用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔制备了特异性强、灵敏度高的多克隆抗体.     

与草菇菌柄伸长相关的bZIP转录因子基因克隆与表达分析

本研究分析了草菇子实体原基、钮扣期菌柄、蛋形期菌柄、伸长期菌柄和成熟期菌柄的表达谱（DGE）,找到一个在伸长期菌柄高表达的基因elnL。PCR克隆测序以及转录组分析结果表明,elnL序列长度1640bp,含有一个内含子,编码526个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域,与双孢蘑菇、双色蜡蘑等担子菌的bZIP转录因子相似性较高。该基因在伸长期菌柄的表达量显著高于其它发育阶段,它可能是一个与草菇菌柄伸长有关的bZIP转录因子。     

猪小脂肪细胞因子1（SMAF1）基因cDNA的克隆及表达谱分析

采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。     

印度南瓜延伸因子基因CmEF1a的克隆与分析

真核生物延伸因子(EF1a)是一种重要的内参基因,广泛应用于RT-qPCR中。为获得印度南瓜EF1a基因,开发合适的荧光定量PCR引物,本研究通过转录组测序和RT-PCR方法获得了1条长度为1 701 bp的cDNA,命名为CmEF1a,GeneBank登录号:MH310443。结果表明,CmEF1a包含1个ORF,大小为1 344 bp,编码447个氨基酸,理论分子大小约为49.30 kD, 蛋白质等电点为9.14。Wolf Psort分析发现, CmEF1a蛋白亚细胞定位于细胞质基质中;Motif Scan分析显示, CmEF1a蛋白质的氨基酸序列2~432位和322~430位分别为EF1结构域和EF1的C端保守结构域。同源性分析表明, CmEF1a基因编码的蛋白质与同为葫芦科的中国南瓜、甜瓜和黄瓜同源蛋白的相似性达到99%,具有高度的保守性。在此基础上设计了1对RT-qPCR引物, 该引物具有较高的特异性和扩增效率, 在印度南瓜不同组织和不同胁迫处理下均能稳定表达, 适合作为内参基因应用于印度南瓜基因表达研究。本研究结果为印度南瓜重要功能基因的表达分析及相关分子调控机制的研究奠定了一定的理论基础。     

凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的构建及其稳定表达细胞株的建立

利用PCR方法扩增凋亡蛋白融合基因片段，克隆至pMD18-T载体，鉴定和测序正确的凋亡蛋白融合基因亚克隆人带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pECFP-C1的多克隆位点EcoRⅠ和SacⅡ之间，成功地构建带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核重组表达载体pECFP-C1-AFG。将带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核表达载体应用脂质体介导使其转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于转染48h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的出现，对转染的CHO细胞，应用Trizol法提取RNA，经RT-PCR鉴定，转染细胞在750bp处出现目的条带。收集转染细胞上清，应用间接ELISA及Western blot检测到目的蛋白的表达，说明凋亡蛋白融合基因构建正确。转染凋亡蛋白融合基因重组质粒的细胞，长成单层后传代，经G418（Genetiein）加压筛选（800μg／mL），3周后在荧光显微镜下观察所有细胞均出现绿色荧光，说明已建立了能够稳定表达凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的细胞株，为进一步研究凋亡蛋白融合蛋白在肿瘤组织中的定位及其诱导肿瘤细胞凋亡打下了基础。     

毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析

WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。     

胡萝卜2个DcDREB-A1类转录因子基因的克隆与比较分析

植物DREB类转录因子在植物抗逆性方面具有重要作用。本文以胡萝卜黑田五寸为材料,基于胡萝卜转录组数据,通过RT-PCR方法克隆出2个DREB-A1类转录因子基因Dc DREB-A1-1和Dc DREBA1-2。序列分析显示,这2个基因均没有内含子,长度分别为780bp和669bp,分别编码259和222个氨基酸;预测其蛋白质相对分子质量分别为29.0KD和24.71KD,p I值分别为4.32和4.63。通过对氨基酸亲水/疏水性进行分析,发现这2个转录因子属于亲水性蛋白。实时定量PCR分析表明,Dc DREB-A1-1和Dc DREB-A1-2基因在胡萝卜不同组织中的表达量不同,分别在叶和根中表达量最高。低温(4℃)、高温(38℃)、盐(0.2 mol·L-1Na Cl)、干旱(200 g·L-1PEG)不同时间段处理表达分析显示,Dc DREB-A1-1在低温、高温、盐和干旱胁迫下被显著诱导,高温、盐和干旱处理1 h后表达量达到最高,分别比对照增加14倍、7倍、7倍,低温处理下2 h表达量最高,是对照的18倍;而Dc DREB-A1-2在高温、低温和盐处理下响应明显,高温处理1 h后表达量为对照的12倍,低温和干旱处理下8 h基因表达量分别比对照增加2.4倍、6.2倍,说明2个基因在响应逆境胁迫时表达不同。胡萝卜响应非生物逆境胁迫是一个复杂的过程,本试验对深入研究胡萝卜抗逆分子机制,提高胡萝卜逆境抗性等方面具有较为重要的意义。     

鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备

利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。