益母草抗菌蛋白LJAMP2的表达及抗菌活性分析

LJAMP2是一种分离自益母草(Leonurus japonicus Houtt.)种子的非专一性脂转移蛋白类抗菌蛋白.将编码成熟的LJAMP2蛋白的基冈(GenBank Accession No.AY971513)插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pas-toris)表达载体pPIC9K中;重组质粒pPIC9K-LJAMP2经线性化后,用电转化法导入毕赤酵母菌株GS115(his-/mut+)中.转化子用含1.75 mg/mL G418的YPD平板筛选获得多拷贝Mut+转化子.将1%甲醇诱导LJAMP2表达后的发酵液,经进一步浓缩、凝胶过滤脱盐、CM FF阳离子交换色谱和反相HPLC进行纯化,获得纯度90%以上的LJAMP2菌株诱导24 h即有LJAMP2的表达,诱导168 h表达量达到最高;表达的LJAMP2蛋白对黑曲霉(Aspergillus niger)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌表现出抑制活性.     

美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

摘要：从美洲商陆（Phytolacca americana）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因,将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K,然后导入毕赤酵母(Pachia pastoris )菌株GS115细胞。在甲醇的诱导下,经过酵母高密度发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析。结果表明,在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为34 kD,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达。     

在毕赤酵母中利用口蹄疫病毒(FMDV)2A实现dTomato和串联MagaininⅡ基因的共表达

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法.     

苏云金芽胞杆菌N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)在毕赤酵母中的优化表达

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(auto inducer inactivation A,aiiA)编码的N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA)能够水解植物病原菌群体效应的信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL),进而使革兰氏阴性细菌群体感应受到抑制,减弱病原菌的致病性。本研究将aiiA基因连接至分泌型穿梭表达载体pPICZαB,获得重组表达质粒p PICZαB-aiiA,线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,获得重组工程菌GS115-p PICZαBaiiA。利用定点突变技术,对aiiA基因进行密码子优化,获得重组工程菌GS115-p PICZαB-MaiiA。以终浓度为1%的甲醇、28℃条件下诱导表达,重组工程菌GS115-p PICZαB-aiiA和GS115-p PICZαB-MaiiA均成功表达并分泌出AiiA蛋白。抗病性分析表明,分泌表达的AiiA蛋白能有效抑制胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)的致病性。AiiA蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,拓宽了AiiA蛋白的获取途径,为AiiA蛋白的产业化提供理论依据。密码子优化为今后改造AiiA蛋白,提高AiiA蛋白的表达效率提供了新的思路。     

源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质分析

β-D-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase,xynA,EC.3.2.1.8)简称β-木聚糖酶(β-xylanase),是木聚糖降解酶系中最重要的成员,广泛用于饲料、食品、造纸和生物能源等领域.厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 xynA具有潜在的开发价值,但是其异源表达的活性较低.本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)对基因密码子偏好性,对厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA进行密码子优化.通过全基因合成技术合成优化后的xynAm,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点,构建重组质粒pPIC9K-xynAm,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,以29℃、0.5％甲醇诱导表达,获得重组xynA,并对该酶的酶学特性进行了研究.结果表明,在摇瓶水平条件下,诱导表达108 h时重组β-木聚糖酶活性达到最大值,为612 IU/mL.在10L发酵罐中诱导表达96 h后,xynA的活性为3 515 IU/mL,比活性为2 411 IU/mg;菌体培养湿重、干重和培养上清总蛋白质的浓度分别为324、156和2.25 g/L.非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝胶电泳显示,重组木聚糖酶的分子量约为42.7 kD.酶学性质分析表明,重组β-木聚糖酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH 6.0,在温度为30～50℃、pH 4.0～10.6之间该酶具有较好的稳定性,其Km=27.86 mg/mL,Vmax=277.78 mg/(mL· min).底物特异性分析表明,重组xynA可水解低粘度阿拉伯木聚糖、高粘度阿拉伯木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖,但不降解大麦(Hordeum vulgare)β-葡聚糖和地衣多糖.10 mmol/L的Co2+和K+对该酶的活性略有激活作用,Mn2+、Fe2+和SDS对该酶活性有一定的抑制作用.本研究为进一步工业化应用来源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的β-内切木聚糖酶奠定了基础.     

抗菌肽基因在毕赤酵母中分泌表达及其条件优化

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽cecropinA(1-8)-melittin(1-18)基因片段,合成片段与酵母表达载体pPIC9K重组,构建胞外分泌表达载体pPIC9K-came,电击法转化毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168宿主菌,对CAME抗菌肽重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明,酵母表达抗菌肽具有抗菌活性且溶血活性显著降低;重组酵母在含2%葡萄糖pH7.0的YPD培养液中,250r/min震荡培养24h后,重组酵母菌的A600为6.0时,经0.5%甲醇在28℃条件下诱导48h能够诱导产生较高抗菌活性的抗菌肽。     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei）RNA为模板，采用RT-PCR扩增的方法获得不带自身信号肽man1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pPIC9K-man1，重组质粒SacⅠ线性化后用PEG（聚乙二醇）法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，通过PCR和表型鉴定表明man1基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株RMAN23。将此菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达470IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

蜡样芽胞杆菌M22Mn-SOD基因的分子改造及在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母(Pichia pastons)密码子的偏好性,以氨基酸序列不变为原则,对源于蜡样芽胞杆菌(Bacillus cernes)M22的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成了新的基因序列Mn-SOD-2.构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体.结果表明,所构建的重组体经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰单一活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量24 kD.酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好.     

内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达及表达条件研究

根据枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列设计引物,采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4Kb的内切葡聚糖酶表达片段。以此片段成功构建了pPIC-End载体,并转化至巴斯德毕赤酵母GS115。经过MD、MM平板筛选和酶活性测定,获得了高效表达的转化子GS115-pPIC-EndⅠ、GS115-pPIC-EndⅦ、GS115-pPIC-EndⅧ。在摇瓶培养条件下,对酵母工程菌表达条件进行了优化研究：在pH4-8条件下均能稳定表达,诱导起始OD600=5表达水平最高,甲醇诱导最佳浓度为0.5%-1%,加大培养通气量对表达有显著的促进作用。三种工程菌在优化条件后诱导培养,酶活性可达860.7U、760.3U、786.2U,分别为原始菌株酶活（63.78U）的13.5倍、11.9倍和12.3倍。SDS-PAGE分析表明表达产物分子量约为79.82KDa,热稳定性分析表明该酶在65℃保温30min可保持最高酶活的80%以上。     

经改造的猪IGF-I基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

采用酵母偏爱密码子合成五条编码猪IGF-I基因的引物，利用重叠PCR技术拼接获得长度为210bp的猪IGF-I成熟蛋白基因。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中，转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌，以1.5%甲醇诱导培养后，经SDS-PAGE检测表达产物，在7.5 kDa处出现一特异蛋白条带，目的蛋白表达量达410mg/L。Dot blot检测表明，重组蛋白可与抗IGF-I多克隆抗体反应。     

甘蓝SRK激酶结构域编码区分子特性及其与THL1相互作用检测

以甘蓝‘E1’为材料，采用PCR和RT-PCR技术，扩增SRK激酶结构域（记为SRKE1）编码区DNA和cDNA序列，得到片段长度分别为1711bp和1241bp，序列分析表明该序列由五个内含子和六个外显子组成，编码407个氨基酸；构建了SRKE1原核表达质粒pET43.1-SRKE1和真核表达质粒pPIC9K-SRKE1，分别在表达宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。用我们表达的THL1与SRKE1孵育，结果显示SRKE1可与THL1结合并形成稳定的复合体。     

Cloning and expression of the XPR2 gene from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris

Yarrowia lipolytica is a dimorphic yeast able to secrete different types of proteases depending on the pH of the environment. At neutral pH, the production of an extracellular alkaline protease (AEP) is induced. This protease could be useful in the leather, detergent, or food industries. The XPR2 gene, coding for AEP, was extracted from the pINA154 vector and cloned into the pHIL-D2 vector to obtain a new protease-producing recombinant Pichia pastoris strain. The gene was efficiently integrated in the P. pastoris genome and expressed from the AOX1 promoter actively induced by methanol. Finally, the protease was successfully secreted by P. pastoris GS115.     

弹性蛋白酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

本研究以一株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的弹性蛋白基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%。将弹性蛋白酶基因连入到表达载体pPIC3.5K中,经过酶切和测序鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到载体启动子下游,成功构建了质粒pPIC3.5K/PAE。将pPIC3.5K/PAE线性化,通过电转化将目的基因转入毕赤酵母KM71中,利用MD培养基筛选到近400个转化子,再经G418抗性的筛选,获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子并用PCR和弹性蛋白平板验证。经过甲醇诱导表达得到高表达的重组酵母菌株,酶活为1060U/mL是出发菌株的26倍。本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础。     

草鱼leptin基因的分离鉴定及在巴斯德毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术扩增出草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的leptin基因,将leptin基因克隆至真核表达载体pPIC9K,电穿孔转化GS115菌株,经G418筛选和甲醇诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳和Westernblot分析。结果表明,草鱼leptin基因cDNA序列由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸组成的多肽(GenBank登陆号AY551335),与鲤鱼(Cyprinuscarpio)leptin基因相比,核苷酸和氨基酸的同源性为99%;与人、猪和鼠相比,核苷酸同源性分别为84%、86%和95%,氯基酸的同源性分别为84%、82%和96%;与河豚(Takifugurubripes)相比,氨基酸具有较大的差异,仅有9%的同源性,表明leptin在物种的进化上具有一定的差异;实现了草鱼leptin基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达,表达蛋白的分子量约为16kD,Westernblot分析表明,表达产物具有一定的免疫学活性。