玉溪醇化烟叶表面细菌酶制剂对烟叶中淀粉和纤维素的降解作用

合理降解烤后烟叶中的淀粉和纤维素含量已成为提高烟叶质量的关键工艺之一。本研究对分离自烤烟叶面的产淀粉酶细菌菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens A1)和产纤维素酶细菌菌株短小芽孢杆菌(B.pumilus C1)进行发酵培养,提取粗酶液,检测酶活性并应用于初烤烟叶上。通过设计不同酶量、作用时间、相对湿度和温度的方法考察这两种酶制剂对烟叶(Nicotiana tabacum K326)中淀粉和纤维素的降解效果。结果表明,菌株A1主要产α-淀粉酶,酶活力为7×105U/mL,菌株C1以产内切酶为主,酶活力为6×103U/mL;在温度40℃、湿度70%条件下作用96h,用菌株A1所产淀粉酶制剂4×107U/kg处理后的烟叶总糖增加率为12.78%,还原糖增加率为12.03%,菌株C1所产纤维素酶制剂4×105U/kg处理后的烟叶总糖增加率为13.87%,还原糖增加率为18.07%。研究结果提示,利用从烟叶表面分离的产酶菌株进行发酵生产的酶制剂可降解初烤烟叶中淀粉和纤维素,提高还原糖含量,可望在烟叶加工过程中得到应用。     

枯草芽胞杆菌FJ-3-16产角蛋白酶条件优化及在生猪脱毛中的应用

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)FJ-3-16是一株角蛋白酶高产菌株,在畜禽废弃物降解和生物脱毛方面有潜在应用价值。为提高菌株B.subtilis FJ-3-16胞外角蛋白酶产量,本研究综合利用单因子实验、Plackett-Burman(PB)设计和中心组合设计(Central composite design,CCD)优化了B.subtilis FJ-3-16的摇瓶产酶发酵条件,优化后的培养基配方为玉米粉1.41%、豆粉3.62%、酪素2%、CaC_l20.16%、K_2HPO_4 0.3%、KH_2PO_4 0.1%、pH 8.0,温度37℃,转速250 r/min,培养时间48 h,胞外角蛋白酶酶活由原有培养基的73.82U/mL提高至166.08 U/mL。且建立了利用50 L发酵罐生产角蛋白酶的发酵工艺,酶活在摇瓶发酵的基础上进一步提高,达207.6 U/mL,同时产酶时间缩短至18 h。同时利用菌株发酵液对巴马香猪(Sus scrofa)的猪蹄、猪头皮张及猪蹄整蹄进行脱毛,效果显著,表明B.subtilis FJ-3-16在巴马香猪为代表的难脱毛生猪的脱毛应用中具有极好的应用前景。本研究为实现角蛋白酶的工业化应用提供了基础资料。     

高产漆酶平菇的筛选及其在降解黄曲霉毒素B1中的应用

通过选择培养基平板培养法和液体发酵培养法筛选得到2株高产漆酶的平菇菌株P1和P2,并对平菇菌株产漆酶的培养基进行筛选,得到产漆酶的最适培养基为最低盐MSM培养基。菌株P1不仅产漆酶能力最高,而且降解黄曲霉毒素的能力也最好。在MSM培养基中培养10d时,产漆酶量高达769.44U/L,在800μl的反应体系中,790μl粗酶液可以将1000ng黄曲霉毒素B₁降解到222.62ng,降解率为77.74%,并且平菇粗酶液降解黄曲霉毒素B₁的能力与其中漆酶的含量呈一定的正相关性。     

产β-甘露聚糖酶内生菌的诱变育种及产酶条件优化

以刺槐豆内生菌Paenibacillus sp.CH-3为出发菌株,采用紫外-硫酸二乙酯-亚硝酸盐对其进行复合诱变,并对菌株的发酵条件进行了优化。结果表明：经过紫外线-硫酸二乙酯-亚硝酸盐复合诱变,获得一株高产β-甘露聚糖酶的突变菌株Paenibacillus sp.CH3-05,其酶活力为160.2U/mL,较出发菌株（42U/mL）提高了281.4%。其最佳发酵培养基为：酵母膏0.25%,魔芋粉3%,磷酸氢二铵0.25%,氯化钠0.1%,硫酸镁0.3%,磷酸氢二钾0.2%,CaCl22 mmol/L。最佳发酵条件为：初始pH 6.5,接种量2%,培养温度35℃,转速200 r/min,培养时间78 h,在该条件下测得酶活为233.5 U/mL,较出发菌株提高456%。     

E.coli谷氨酸脱羧酶高产菌株选育及发酵条件研究

以普通大肠杆菌(E. coli)为出发菌株,以L-谷氨酸、溴甲酚绿(pH3.8~5.4)为筛选及指示剂,经亚硝基胍(NTG)、UV诱变处理,得到了L-谷氨酸脱羧酶活性变异菌株,其L-谷氨酸脱羧酶（GAD）活性大幅度提高,比出发菌株酶活性提高了2.22倍。优化实验显示：pH值、发酵时间、诱导剂L-谷氨酸、硫酸镁对GAD产酶有较大影响。通过对产酶发酵培养基中几种成份单因素变动及正交优化实验,对该菌株产GAD的诱导剂L-谷氨酸、营养要求和发酵条件进行了研究,优化后的发酵培养基组成为牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化钠3 g/L,L-谷氨酸0.5 g/L,葡萄糖1.5 g/L,磷酸二氢钾2 g/L,硫酸镁0.7 g/L。发酵条件是：pH6.8,接种菌龄20h,发酵时间20h。在优化条件下突变菌株GAD活性可达6790.7U,是出发菌株的2.76倍。     

啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化

对产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A302菌株进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合诱变和选育，获得产β-葡聚糖酶达27．3U／mL的突变株H302。采用均匀实验设计对H302菌株产β-葡聚糖酶的液体培养基组成及发酵条件进行优化实验，所获优化配方(W／V)为麦麸1．41％，鱼粉0．80％，硝酸钾0．34％，硫酸镁0．11％，起始pH6．0；用含孢量10^8个／mL的种子菌液按体积比3．3％接种上述液体培养基，在36℃下发酵52h，菌株H302的产酶活力达到115．1U／mL，是原出发菌株及培养条件下产酶活力的9．4倍。对突变株H302所产β-葡聚糖酶性质的研究表明，该酶最适作用温度为60℃，最适作用pH为5．5，适用于啤酒生产中的麦芽糖化。     

细菌酶制剂对烟叶中蛋白质的降解作用研究

如何有效利用外源酶降解烟叶中的残留蛋白质,进一步提升烟叶质量成为烟草行业研究的新课题。本研究通过对玉溪烤烟叶面的细菌菌株的筛选鉴定,得到一株高产蛋白酶菌株,对其发酵培养制备成酶制剂,测定酶制剂活力并进行酶制剂性质研究。通过正交试验设计考察该酶制剂在不同施酶量(40、80和120 U/g烟叶)、温度(25、35和45℃)、相对湿度(50%、60%、70%)和作用时间(30、60和90 h)条件下对烟草(Nicotiana tabacum)K326中蛋白质的降解作用,并进一步分析了最优条件处理下烟叶香气成分的含量变化。结果表明,分离自烤烟烟叶表面的高产蛋白酶活菌株为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)B1,所产蛋白酶活力为4 200 U/mL,最适温度50℃,最适pH 6.0。正交试验表明,其降解烟草蛋白的最适水平为加酶量120 U/g、温度35℃、相对湿度70%、作用时间60 h,蛋白质降解率为18.64%,氨基酸增加率为12.72%,同时烟叶中各香气成分也有不同程度增加。研究结果提示,以玉溪烟叶表面的细菌菌株为材料制得的细菌酶制剂处理醇化烟叶,可有效降解烟草中的大分子蛋白,缩短烟叶醇化时间,同时烟叶品质得到提升,该酶制剂可望在工业生产中应用。     

玉米秸秆降解真菌的筛选鉴定

为筛选适宜的玉米秸秆纤维素降解菌株作为玉米秸秆腐熟菌剂菌株资源储备，通过采用腐殖玉米秸秆土壤微生物培养筛选、刚果红水解圈测试及酶活测定等多种方法的应用，筛选得到2株具有纤维降解能力的真菌1#菌株和2#菌株。经形态学和分子生物学鉴定，初步确定1#菌株为长枝木霉，2#菌株为聚多曲霉。真菌1#菌株和2#菌株在刚果红培养基上均呈现比生长圈大2倍的水解圈。2个菌株在液体、固体2种酶液发酵情况下均表现内切酶活较强(65.202～217.614 U/mL)，均高于外切酶活(55.398～85.322 U/mL)和滤纸酶活(46.074～141.366 U/mL)，认为这2个菌株可作为玉米秸秆专用腐熟菌剂研发的储备菌株。     

一株从金钱树上分离的产纤维素降解酶的菌株的分离及特性鉴定

本研究从金钱树（Zamioculcas zamiifolia）白绢病（Southern blight）病株上分离到一株产纤维素酶菌株SM,经形态观察和rDNA—ITS序列分析鉴定为齐整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc）,经以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基培养和刚果红染色测定,证明SM菌株可产生高活性纤维素降解酶。本文对SM菌株产纤维素降解酶的液态发酵条件进行了研究,结果表明：在起始pH6．0,无机氮：有机氮：纤维素碳源之比为0．07g：1．4g：1．6g,温度为30℃,摇床转速为160r／min,发酵培养时间为5d的条件下,该菌株发酵液的CMC酶活性达到11．7U／mL,滤纸酶活性达到2．156U／mL,β-葡萄糖苷酶活性达到3．911U／mL。     

一株高活性纤维素降解细菌的筛选鉴定及酶学特性

利用小麦/玉米秸秆还田土壤样品,通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离出纤维素降解细菌XWS-12;对分离的菌株进行16S rRNA基因序列系统发育分析,初步鉴定为伯克氏菌属(Burkholderia),定名为Burkholderia sp.XWS-12。以玉米秸秆和麸皮为碳源,研究了氮源、发酵时间、初始发酵温度、培养基初始pH等条件对该伯克氏菌产纤维素酶的影响。结果显示,该菌株产纤维素酶最适氮源为硝酸钠,培养时间为60 h,培养温度为37℃,培养基初始pH为4,该菌株的CMC酶活力最高,可达25 U/ml。其粗酶液的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5,在pH 4~8的范围内酶活力较稳定。粗酶液的热稳定较差,当温度超过50℃时,该酶活力显著下降;当温度为50℃时,保温1 h,该酶活力损失53%。     

西安市北郊污灌区土壤中抗铅链霉菌的多样性分析

从西安市北郊污灌区采集土样,用添加K2Cr2O7 75 μg·mL^-1和青霉素2 μg·mL^-1的高氏1号、HV和SC固体培养基分离到120株具有链霉菌特征的放线菌。采用浓度梯度法,用含Pb^2＋培养基对分离菌株进行筛选,得到50株抗铅链霉菌。在抗铅能力实验结果的基础上,选取14株抗性较强链霉菌代表菌株进行形态培养特征、生理生化和16S rDNA基因序列相似性等分析。结果表明,14株代表菌株可归为6个不同的颜色类群,其表型特征与生理生化性质和链霉菌相符合,在系统发育树上处于8个不同的进化分支。菌株HQ0031与已知链霉菌相似性差异较大,可能为链霉菌属内1个潜在新种。研究表明西安市北郊污灌区土壤中抗铅链霉菌具有丰富的多样性,可为重金属污染环境的生物修复提供有益的微生物资源。     

牛粪堆肥中高效菌株的筛选与应用效果

为了探索牛粪快速腐熟原理及方法,以糖、淀粉、蛋白质、纤维素、油脂培养基为筛选培养基,以菌株增殖倍数、菌株性能等为筛选条件,从牛粪常温堆肥中筛选不同原料高效功能菌,并组成功能菌剂;以不同原料菌及单菌株发酵试验对发酵机制进行研究。结果表明,芽孢杆菌、假单胞菌、木霉及曲霉等为重要功能菌,组成功能菌剂发酵升温快,进入高温期仅需4 d,发酵腐熟时间可缩短至19~20 d;发酵及升温效果依次为糖原料功能菌淀粉原料功能菌蛋白质原料功能菌纤维素原料功能菌;芽孢杆菌、假单胞菌、木霉、曲霉利用糖、淀粉、蛋白质及纤维素能力强,升温及腐熟效果好。各菌株充分利用基质各成分,紧密协同生长及代谢,迅速进入高温期,是堆肥快速发酵及腐熟的主要作用机制。     

菜豆根瘤菌对土壤无机磷的活化释放作用

以土壤为磷源,通过液体培养研究了7株菜豆根瘤菌(Rhizobium sp.)对土壤磷的利用。结果表明,菜豆根瘤菌能释放大量的氢离子,使液体培养基的pH大幅度降低,氢离子的浓度至少提高20倍以上。根瘤菌分泌有机酸的种类与数量因菌株不同而异,这些有机酸包括甲酸、乙酸、草酸、丁二酸、柠檬酸、苹果酸和乳酸等,大部分根瘤菌能分泌乙酸。在接种根瘤菌的液体培养基中,全磷含量显著高于不接种的液体培养基,土壤无机磷总量则显著降低。由于土壤是培养基磷的唯一来源,故根瘤菌可促进土壤无机磷的溶解释放。相关分析表明,培养基的pH与土壤无机磷总量呈极显著正相关(r=0.893**,n=8),说明根瘤菌分泌的氢离子可能是溶解土壤无机磷的原因之一。接种根瘤菌显著降低土壤闭蓄态磷,土壤中的铁磷、铝磷和钙磷因菌株不同而降低,其原因可能与有机酸分泌的数量和种类有关。根瘤菌既能释放氢离子又可分泌多种有机酸的现象表明其活化土壤无机磷的方式具有多样性,可能有益于豆科植物利用不同形态的难溶性磷,使之适应各种不同的低磷土壤。     

原料差异对厌氧消化微生物群落的影响

以餐厨垃圾、果蔬垃圾、麦秸3种不同原料分别进行厌氧消化,研究了各反应器在最佳运行条件下的消化特性和微生物群落组成。结果表明：VS产气率由高到低依次为餐厨垃圾（756.4mL·g-1VS-1）、麦秸（696.5mL·g-1VS-1）和果蔬垃圾（433.5mL·g-1VS-1）,甲烷含量在51.5%～55.1%之间,利用PCR-DGGE技术系统地分析了不同原料消化系统内细菌和古菌的群落结构构成及差异。结果表明,虽然3组样品中细菌和古菌的群落存在相同的优势微生物,但其数量和群落结构差异也较为明显,细菌中以拟杆菌（Bacteroidetes）以及古菌中甲烷鬃菌属（Methanosaeta）和甲烷螺菌属（Methanospirillum）均为样品共有的优势微生物。     

两个对浓核病毒（镇江株）具感性差异的家蚕品种的血液和围食膜蛋白的比较

家蚕品种间对浓核病毒（镇江株）具有不同的感染性,为了进一步探明家蚕对浓核病毒（镇江株）感性差异的分子机制,本文运用蛋白质电泳和质谱技术比较分析了两个对家蚕浓核病毒（镇江株）感性和抗性的近等基因系家蚕品种JS和NIL的血液和围食膜组织蛋白。结果表明：这两个家蚕品种的血液和围食膜组织蛋白组成差异很小。在血液组织蛋白中发现5个差异蛋白点,其中家蚕品种JS血液中有两个差异蛋白,可能分别为酪蛋白激酶和新型组织蛋白;在NIL血液组织中发现3个差异蛋白点,其中两个可能分别为线粒体延伸因子和类丝氨酸蛋白酶,另外1个的含量极显著高于JS,为血淋巴蛋白。在围食膜蛋白中共发现4个差异蛋白点,其中JS围食膜中有1个差异蛋白可能为新型组织蛋白;其余3个蛋白点在含量上相互间存在显著差异。本研究根据组织差异蛋白的功能初步推测家蚕对浓核病毒（镇江株）感性差异与血液蛋白差异无显著相关,与围食膜蛋白差异可能有关。     

水稻根际耐镉细菌碳源代谢功能分析

为探明前期分离得到的3株水稻根际耐镉细菌碳源代谢特性,在进行生理生化鉴定的基础上,采用BIOLOG ECO微平板法,分析了3株细菌(菌株A、菌株B和菌株C)的碳源代谢功能。生理生化试验结果表明,3株菌均属于革兰氏阴性细菌,且均具有极生鞭毛,菌株C的生理生化鉴定为铜绿假单胞菌,菌株A与菌株B为假单胞菌属的其他种,结果与之前的分子生物学鉴定结果一致。BIOLOG分析结果表明,3株菌株在培养72 h的AWCD(平均颜色变化率)均接近最大值,在培养24 h时的AWCD存在显著差异,这种差异主要体现在对氨基酸的利用上。在对提供的31种单一碳源利用上,3株菌对N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-精氨酸、L-天冬酰胺、甲叉丁二酸、腐胺、4-羟基苯甲酸、丙酮酸甲酯、吐温-40和吐温-80的利用率均较高,且对L-精氨酸、甲叉丁二酸、丙酮酸甲酯的利用率存在显著差异。本研究结果对深入了解耐镉菌株增殖所需要的碳源以及将来优化耐镉细菌最适培养基提供了理论依据,也为构建相应的基因工程菌提供了微生物资源。     

杂交技术培育金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株

为培育金针菇尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株,将金针菇尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株NG1-65、NG1-92和NG1-95(A1B1)分别与可亲和的野生型单核菌株DG1-29(A2B2)杂交得到3株杂交菌株SGN1、SGN2和SGN3,通过栽培试验获得这3株双核体菌株的子实体,收集孢子后通过涂布于选择培养基和镜检获得206株尿嘧啶营养缺陷型单核体菌株,从中随机选取30株单核体菌株,通过单单杂交得到38株尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。结果表明,这些尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株在不含尿嘧啶添加物的基本培养基中无法正常生长,在PDA培养基上生长速率低于野生型菌株,在添加尿嘧啶的PDAU培养基上可以不同程度地恢复正常生长。本研究结果为进一步利用营养缺陷型菌株开展金针菇杂交育种、菌种保护等方面研究提供了一定的技术支撑。     

煤矸石等组成的无土栽培基质重金属污染及蔬菜安全评价

利用煤矸石、油菜秸秆等废弃资源为原料,按（煤矸石：腐熟秸秆）体积比为2：8、3：7、4：6、5：5和6：4的比例配制成5种混合基质,在人工光照室内以盆栽的方法栽培白菜、生菜、苋菜、菠菜、茄子、番茄、辣椒和萝卜8种蔬菜,采用尼梅罗综合污染指数和Hakanson潜在生态风险指数法对5种混合基质以及其上生长的8种蔬菜的重金属污染和潜在生态风险进行了综合评价。结果表明,5种混合基质中,煤矸石含量较少的T1、T2、T3基质的重金属污染程度较小,潜在生态风险程度较低,在这3种基质上栽种的蔬菜重金属综合污染评价等级为优良或安全,符合蔬菜绿色食品标准。重金属对混合基质产生的污染中,Cd和Hg是主要的重金属污染及潜在生态风险因子,其他重金属的污染能力较小。另外,在评价由煤矸石为无机原料组成的有机生态型无土栽培基质的重金属污染及潜在生态风险时,应选择国家土壤环境质量一级标准作为参比值,且煤矸石在混合基质中所占的体积比一般不应超过1/2。     

Differential copper impact on density,diversity and resistance of adapted culturable bacterial populations according to soil organic status

The effect of copper on the abundance, diversity and resistance of viable heterotrophic and copper resistant bacterial populations (Cu^R) was evaluated in soils differing only by their amount and type of organic matter. These soils have been obtained using a vineyard soil that had been subjected to three different organic matter managements (Not Amended (NA) or amended with Straw (S) or Conifer Compost (CC)) in a long term field experiment. Soil microcosms were artificially contaminated with copper (250 mg Cu kg^?1 of soil) and incubated for 35 days. Throughout the incubation, a differential copper impact on viable heterotrophic and Cu^R bacterial enumeration was demonstrated according to the soil organic status with a magnitude which followed the order: NA > CC ≥ S. Diversity of Cu^R bacteria revealed no significant difference between the uncontaminated soils, as determined by 16S rRNA sequencing. However, copper spiking induced an enrichment of particular populations depending on soil, with Methylobacterium, Ralstonia and Staphylococcus like species becoming dominant in NA, S and CC soils, respectively. Evaluation of the copA gene distribution and diversity, through PCR detection and sequencing, revealed that few Cu^R bacteria (from 7 to 13%) possessed this genetic determinant before the addition of metal. Copper contamination induced an increase in the dissemination of homologous copA genes only in Ralstonia like species indigenous to S soils. From a functional point of view, copper minimum inhibitory concentration for each Cu^R strain was measured. It did not highlight variable copper resistance efficiency between strains belonging to different taxonomic groups, harboring or not the copA gene, and originating from different soils contaminated or not by copper.     

小麦根际固氮菌、解磷菌及解钾菌的互作效应

固氮菌N2106、解磷菌P1616、解钾菌K0405是从小麦根际分离的分别具有高效固氮、溶磷、解钾功能的细菌,N2106-L、KL0405是发光酶基因LuxAB标记N2106及K0405所获得的标记菌株。将以上5种菌株分别单独培养并测定各菌悬液的细胞密度,然后将各菌株以相等的细菌数目进行混合液体培养。共设置4个不同的组合:N2106-L P1616、N2106-L K0405、KL0405 P1616以及N2106-L KL0405 P1616,研究这些菌株之间的相互作用。结果表明,标记菌株的细胞密度均低于原始菌株1个数量级;两种菌株混合培养时,P1616促进了N2106-L和KL0405的生长,N2106-L和K0405之间存在某种相互作用;3种菌株混合培养时P1616为混合培养液中的优势菌种。