环磷酰胺诱导黄羽肉鸡免疫抑制的研究

180只墟岗黄雏鸡随机分为4组，第1组为对照组，第2至4组为处理组，10日龄开始。对照组胸肌注射0．5mL的生理盐水，第2至4组分别按40、80和160mg／kg的剂量，同部位注射用生理盐水稀释的环磷酰胺(cyclophosphamide,CY)0．5mL；1次／d，连续注射3d．21、35、56日龄时每组随机抽取10只鸡进行屠宰取样；测定各组鸡的器官指数。另取3只鸡，测定脾脏淋巴细胞增殖转化和脾脏抗体形成细胞的数量。试验结果表明：一定剂量的环磷酰胺能显著降低墟岗黄鸡早期的体质量，且效果与注射剂量呈依赖关系；降低鸡早期脾脏指数和法氏囊指数；显著减少由ConA诱导的脾脏淋巴细胞的增殖转化；减少鸡早期脾脏抗体形成细胞的数量。     

鸡IgG单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]制备鸡免疫球蛋白单克隆抗体,提高诊断鸡特异性抗体的水平。[方法]应用盐析法粗提和葡聚糖G200凝胶层析分离纯化鸡血清IgG,免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合和ELISA筛选。[结果]间接ELISA法检测C44、C45、C67和C68共4株鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞的腹水效价分别为1∶640000、1∶320000、1∶640000和1∶80000。Westernblot分析显示,C44和C45株单克隆抗体识别鸡IgG轻链,而C67和C68株单克隆抗体识别鸡IgG重链,它们与鸭、猪等血清Ig均没有反应。小鼠Ig亚类分析表明,4株细胞分泌的抗体均为IgG1型。[结论]成功获得了4株稳定分泌鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞。     

新城疫病毒单克隆抗体研究Ⅲ酶标单克隆抗体ELISA夹心法检测鸡新城疫病毒抗原

应用双抗体ELISA夹心法检测禽类新城疫病毒(NDV)抗原,用单克隆抗体或多克隆抗体包被固相载体,将活化的40孔板作为捕捉待检新城疫病毒抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)与单克隆抗体的结合物作为示踪抗体,比较了单克隆抗体和多克隆抗体的捕捉效率.结果表明,NDV单抗2C₁₂、4H₁₀优于血清IgG,同时确定了双抗体ELISA夹心法对不同日龄健康鸡组织产生背景反应的O.D.值基本参数,以X+2SD为判定阈值.捕捉抗体2C₁₂、4H₁₀的工作浓度为500～400μg/ml;示踪抗体2C₁₂、4H₁₀的工作浓度为1:3000～1:2000,ELISA夹心法的灵敏度可达4μgNDV蛋白/ml;对NDV不同毒株感染鸡各脏器的NDV检出率为:肾100%、肺90%.证明用双抗体ELISA夹心法检测鸡新城疫病毒抗原特异,敏感,是禽类新城疫病毒检测的新途径.     

抗重组鸡IL-2单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的重组鸡IL-2蛋白(rchIL-2)为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,最终获得4株持续且稳定分泌抗鸡IL-2单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为:1A12、4A3、3E7和4E1.4株MAb的抗体类型均为IgG1,轻链为κ;MAb的ELISA效价分别为5.12×105、1.02×106、2.56×105和4.09×106.Western-blot分析表明,所获得的1A12、4A3、3E7和4E1 4株单克隆抗体与rchIL-2均有反应.MAb的制备成功为进一步开展chIL-2的功能研究奠定了基础.     

ClassⅠ新城疫病毒单克隆抗体的制备

本试验以纯化的新城疫病毒(NDV)弱毒株D58为免疫原免疫6～8周龄BALB/c小鼠,分离脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,经多次ELISA鉴定和血凝抑制试验(HI)筛选和亚克隆培养,获得了4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞并制备了单抗。经鉴定,4株单抗均有ELISA效价,其中1株单抗有中和活性和HI活性,只与ClassⅠNDV反应,与ClassⅡNDV不反应。该单抗与不同群NDV反应的差异性为NDV的鉴别诊断和不同毒株抗原差异性研究奠定了一定基础。     

抗鸡CD25单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的鸡IL-2Rα(chCD25)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得1E1,1G1,4H5,5E1,6A1,6C2,6C9 7株能稳定传代并分泌抗chCD25单克隆抗体的杂交瘤细胞.该7株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达106以上.除了1E1为IgG2b外,抗体类型均为IgG1,轻链皆为κ.经Western blot和免疫细胞化学分析表明,7株单克隆抗体皆与chCD25重组蛋白和真核表达蛋白EGFP-chCD25反应.抗chCD25单克隆抗体的获得为开展禽类分子免疫学研究提供了一种新的工具.     

抗沙丁胺醇单克隆抗体制备与鉴定

[目的]制备特异性抗沙丁胺醇单克隆抗体,为其免疫学检测方法的建立奠定基础。[方法]用SAL-BSA抗原免疫BALB/c小鼠;使用细胞融合技术建立抗SAL的单克隆抗体（SAL mAb）杂交瘤细胞株;体内诱生腹水法制备SAL mAb,并鉴定其免疫学特性。[结果]筛选出2D9和1C4两株杂交瘤细胞,其细胞培养上清效价达1∶104,腹水效价达1∶106;免疫球蛋白亚型鉴定为IgG1;抗体对SAL的半数抑制浓度（IC50）为1.14 ng/ml;与沙丁胺醇和盐酸克伦特罗的交叉反应率（CR）分别为100.00%和26.09%,与其他化合物无交叉反应。[结论]获得了高效价、敏感且异性的抗SAL抗体,为沙丁胺醇残留的免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

鸭肝炎病毒单克隆抗体的研究

[目的]研制鸭肝炎病毒的单克隆抗体。[方法]将DHV-W株的鸭胚尿囊液经冻融、氯仿处理和超速离心纯化后,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,探讨DHV特异性强、敏感性高、简便快速的DHV抗原诊断方法。[结果]经间接ELISA筛选获得1株能稳定分泌DHV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5G8。特性鉴定结果表明该株单抗ELISA效价较高且特异性好,中和特性稍差。杂交瘤细胞冻存6个月和12个月后复苏能稳定分泌特异性抗体。[结论]HDV的McAb成功制备为DHV的快速诊断、筛选特定基因探针等技术奠定了基础。     

温和气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析

利用细胞融合技术建立了5株分泌抗温和气单胞菌CR79-1-1株单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,特异性鉴定获得2株与参考菌株中的温和气单胞菌发生反应,并且与嗜水气单胞菌以及鳗弧菌、爱德华氏菌、克鲁氏耶尔森菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌均不反应的杂交瘤细胞,命名为2G3、1A4;快速酶联免疫分析法测得2G3、1A4的亲和常数为5×108L/mol、1.725×108L/mol;应用方阵配对试验证实,2株单抗针对特异性抗原上不同表位。     

恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性

将恩诺沙星(ENR)偶联于载体蛋白BSA,形成完全抗原(BSA-ENR)并免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术制备分泌抗恩诺沙星的杂交瘤细胞株,用体内诱生腹水法生产ENR单克隆抗体。结果筛选出4G1-B3,4G1-G1和4G1-B9 3株敏感特异的杂交瘤。3株单抗对ENR的半数抑制浓度(IC50)分别为1.04 ng/mL,2.44 ng/mL,4.24 ng/mL。4G1-B3与环丙沙星有0.02%的交叉反应,与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%;4G1-G1和4G1-B9与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%。     

猪肺炎支原体168株特异性单抗的制备及鉴定

将猪肺炎支原体168株全菌蛋白免疫小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,3次亚克隆后,获得了4株针对168株全菌蛋白的单抗,分别将其命名为2F5、2G7、4F5、5E9。Western-blot检测结果表明,2G7、4F5与猪肺炎支原体具有特异性反应条带,不与猪鼻支原体、大肠杆菌反应。亚型鉴定结果表明,两株特异性单抗(2G7、4F5)的亚型属IgG1,轻链为κ型,2F5、5E9亚型属IgG2a,轻链为κ型。间接免疫荧光结果表明,4株单抗均与猪肺炎支原体168株有特异性荧光反应,特异性单抗的获得为猪肺炎支原体的检测及机理研究奠定基础。     

抗重金属Cr3+单克隆抗体的研制及其免疫学特性分析

旨在研制敏感、特异、稳定的抗Cr~(3+)单克隆抗体(Cr~(3+)mAb)。用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)鳌合Cr~(3+)形成Cr~(3+)-ITCBE半抗原,异硫氰酯法制备人工免疫原Cr~(3+)-ITCBE-BSA和检测抗原Cr~(3+)-ITCBE-OVA,紫外扫描法(UV)、凝胶电泳法(SDS-PAGE)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICPAES)进行免疫原鉴定;用Cr~(3+)-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立Cr~(3+)mAb杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备Cr~(3+)mAb,并对其免疫学特性进行分析。结果表明,免疫原制备成功,Cr~(3+)-ITCBE-BSA中Cr~(3+)和BSA的质量浓度分别为140.8mg/L和5.81g/L,筛选出2A3C11、2A3D9、2A11G5 3株杂交瘤细胞,其中最好的2A11G5间接ELISA效价细胞培养上清为1∶(2.56×103)、腹水为1∶(5.12×105),同种型为IgG1/κ,亲和常数(Ka)为2.69×109 L/mol,对Cr~(3+)的半数抑制质量浓度(IC50)为16.6μg/L,与其他重金属离子无交叉反应。表明成功研制亲和力高、特异性强、稳定性好的Cr~(3+)mAb,为铬离子残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。     

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒(CDV)抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶(8 000~128 000),细胞培养上清效价为1∶(256~512),染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。     

抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

[目的]制备抗猪瘟病毒（CSFV）的单克隆抗体（MAb）。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4～6周龄BALB／c雌鼠,取其脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1AS、5F3和4D2。Mab亚型鉴定表明3株MAb均为IgG2b,轻链均为K链。Westernblot结果表明3株Mab均能识别重组E2蛋白。间接免疫荧光试验表明3株Mab均与CSFV呈阳性反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）呈阴性反应。[结论]该研究为建立CSFV特异性检测方法奠定了基础。