鱼诺卡氏菌动力蛋白调节蛋白robl/LC7的亚细胞定位和功能初步研究

鱼类诺卡氏菌病是一种慢性系统性肉芽肿疾病,鱼诺卡氏菌是其主要病原。鱼诺卡氏菌全基因组生物信息学分析,发现了一个可能靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白——动力蛋白调节蛋白robl/LC7。为了对鱼诺卡氏菌robl/LC7的亚细胞定位和功能进行初步研究,实验对鱼诺卡氏菌robl/LC7进行了基因克隆、真核表达重组质粒构建、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和凋亡检测。结果显示,成功克隆了鱼诺卡氏菌robl/LC7基因并构建了其真核表达质粒p EGFP-robl/LC7和pc DNA-robl/LC7;鱼诺卡氏菌分泌蛋白质谱鉴定证实robl/LC7为分泌蛋白;亚细胞定位研究显示robl/LC7-GFP融合蛋白呈全细胞分布,不与线粒体共定位;凋亡检测发现robl/LC7过表达能诱导FHM细胞凋亡。研究表明,鱼诺卡氏菌robl/LC7是一个不与线粒体共定位的分泌蛋白,其可能通过参与细胞凋亡调控,协助鱼诺卡氏菌在宿主体内生存和免疫逃避,并在鱼诺卡氏菌的致病过程中具有重要作用。     

哈维弧菌rbsB基因的克隆与表达

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水鱼养殖中一种重要的病原菌。该研究根据已知rbs B(核糖体结合蛋白)基因序列设计引物,扩增得到哈维弧菌354(V.harveyi 354)rbs B基因的全序列(Gen Bank序列号MF797015),预测该序列可编码292个氨基酸,分子量为30.7 k D,理论等电点为5.05,亲水性系数为0.043,为疏水性蛋白。根据Rbs B氨基酸构建的系统进化树可以发现哈维弧菌Rbs B蛋白和欧文弧菌(V.owensii CAIM 1854)的关系最近。构建了p GEX-4t-1-rbs B重组质粒并转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,得到的重组蛋白的相对分子量约59 k D,在37℃、IPTG浓度为0.6 mmol·L–1诱导8 h时表达量最高。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的截短表达及其免疫原性分析

为了揭示鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)糖蛋白编码基因的主要免疫原性决定区域,本研究对SVCV的糖蛋白基因进行截短表达,并用纯化的重组蛋白作为免疫原制备了兔抗血清以分析其免疫原性。通过SOSUI以及DNAStar 6.0软件对SVCV糖蛋白基因的跨膜区、亲水性以及抗原表位进行分析后,采用RT-PCR对该基因主要抗原决定区域编码片段进行扩增,并构建重组表达质粒p GEX-Gtr,对其进行诱导表达后获得截短的SVCV糖蛋白的重组蛋白。将表达的重组蛋白进行纯化复性后,作为免疫原制备兔抗血清,采用ELISA法检测其效价,采用免疫印迹以及间接免疫荧光技术检测该重组蛋白的免疫原性。研究结果显示,截短表达的糖蛋白编码基因长1317 bp,编码439个氨基酸(29~467),推测分子量为49.6 k D。利用该重组蛋白制备的兔抗血清,其与重组蛋白的反应效价为1∶64000,。免疫印迹及间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清与SVCV-HN株能发生特异性反应,表明该重组蛋白与天然的病毒表面糖蛋白的免疫原性无差异。上述研究结果表明,截短表达的重组蛋白具有很好的免疫原性,可应用于免疫诊断技术研发与基因工程疫苗的研制。     

鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交试验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明,鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25℃、盐度5、pH 6.5±0.2;经筛选,鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉,促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾(K2HPO4)和氯化钙(CaCl2);确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1,酵母粉15 g·L-1,K2HPO40.75 g·L-1,CaCl20.2 g·L-1(单独灭菌),氯化钠(NaCl)5 g·L-1,pH 6.5±0.2。     

4株长牡蛎(Crassostrea gigas)致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鉴定及其毒力基因检测

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水鱼养殖中一种重要的病原菌。该研究根据已知rbsB (核糖体结合蛋白)基因序列设计引物,扩增得到哈维弧菌354 (V.harveyi 354) rbsB基因的全序列(GenBank序列号MF797015),预测该序列可编码292个氨基酸,分子量为30.7 kD,理论等电点为5.05,亲水性系数为0.043,为疏水性蛋白。根据RbsB氨基酸构建的系统进化树可以发现哈维弧菌RbsB蛋白和欧文弧菌(V.owensii CAIM 1854)的关系最近。构建了pGEX-4t-1-rbsB重组质粒并转化至大肠埃希菌BL21 (DE3)中,得到的重组蛋白的相对分子量约59 kD,在37 ℃、IPTG浓度为0.6 mmol·L^–1诱导8 h时表达量最高。     

鱼诺卡氏菌研究进展

正诺卡氏菌(Nocardiasp.)是一种革兰氏阳性丝状杆菌,具有抗盐、碱,耐干旱的特点,广泛分布于土壤、水体、空气、腐烂植物和动物粪便中[1-2]。该菌为条件致病菌,其中某些种类为人畜共患[1]。目前,已发现鱼诺卡氏菌(N.seriolae)、星状诺卡     

一种(鱼师)鱼诺卡氏菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆及功能初步研究

這鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,可导致鱼类慢性系统性肉芽肿疾病.這鱼诺卡氏菌全基因组序列分析发现了一个酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphtase,PTP)基因,生物信息学分析显示该基因很可能编码一个靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白.本实验对這鱼诺卡氏菌PTP进行了基因克隆、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和线粒体膜电位检测,结果显示,在這鱼诺卡氏菌胞外产物中质谱鉴定到了PTP肽段,证实其为分泌蛋白.亚细胞定位研究观察到PTP-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明這鱼诺卡氏菌PTP蛋白并未靶向定位于线粒体.亚细胞定位和过表达研究都显示PTP蛋白在FHM细胞中表达后,细胞核出现固缩浓染、凋亡小体等明显的细胞凋亡特征.通过线粒体膜电位检测表明,在pcDNA-PTP转染后48 h,线粒体跨膜电位被明显破坏,说明這鱼诺卡氏菌PTP很可能是一种可诱导细胞凋亡的细菌蛋白.通过对這鱼诺卡氏菌PTP开展基因克隆和功能初步研究,为进一步揭示该基因的功能和深入了解這鱼诺卡氏菌的分子致病机理奠定了基础.     

一种鰑鱼诺卡氏菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆及功能初步研究

這鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,可导致鱼类慢性系统性肉芽肿疾病。這鱼诺卡氏菌全基因组序列分析发现了一个酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphtase,PTP)基因,生物信息学分析显示该基因很可能编码一个靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白。本实验对這鱼诺卡氏菌PTP进行了基因克隆、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和线粒体膜电位检测,结果显示,在這鱼诺卡氏菌胞外产物中质谱鉴定到了PTP肽段,证实其为分泌蛋白。亚细胞定位研究观察到PTP-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明這鱼诺卡氏菌PTP蛋白并未靶向定位于线粒体。亚细胞定位和过表达研究都显示PTP蛋白在FHM细胞中表达后,细胞核出现固缩浓染、凋亡小体等明显的细胞凋亡特征。通过线粒体膜电位检测表明,在pcDNA-PTP转染后48 h,线粒体跨膜电位被明显破坏,说明這鱼诺卡氏菌PTP很可能是一种可诱导细胞凋亡的细菌蛋白。通过对這鱼诺卡氏菌PTP开展基因克隆和功能初步研究,为进一步揭示该基因的功能和深入了解這鱼诺卡氏菌的分子致病机理奠定了基础。     

锦鲤疱疹病毒3型ORF126基因克隆及生物信息学分析

为研究锦鲤疱疹病毒3型(KHV-3)ORF126基因编码蛋白的功能,我们对该蛋白的结构特征进行研究分析。本实验采用PCR扩增技术获得KHV ORF126基因的完整序列,构建pMD19-T-ORF 126重组质粒,应用生物信息学方法分析ORF126基因编码蛋白的理化特征。结果显示:KHV ORF126基因翻译合成273个氨基酸;ExPasy预测该蛋白的理论分子量为29.9kDa,等电点为5.11;信号肽的切割部位最可能位于第19~20位氨基酸之间;跨膜区位于第145~168位氨基酸;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白不含N-糖基化位点,含有4个O-糖基化位点和17个磷酸化位点。     

三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。     

脊尾白虾水通道蛋白基因4和11在碱度胁迫过程中的作用

水通道蛋白(aquaporin)是一种细胞膜上特异性转运水分子及其他中性代谢分子的膜蛋白家族,对生物的细胞内外渗透压稳定具有重要的调节作用。为了了解水通道蛋白在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)应对碱度胁迫中的作用,本研究利用RACE技术成功克隆了脊尾白虾水通道蛋白4 (aquaporin 4, EcAQP4)与水通道蛋白11 (aquaporin 11, EcAQP11)基因cDNA全长,EcAQP4基因的开放阅读框为621 bp,编码206个氨基酸,预测分子量为21.673 kDa,理论等电点为8.30,为疏水性蛋白,具有5个跨膜结构域;EcAQP11基因的开放阅读框长度为783 bp,编码260个氨基酸,预测蛋白分子量为28.490 kDa,理论等电点为5.40,为疏水性蛋白,具有4个跨膜结构域。序列比对结果显示,EcAQP4基因与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)同源性最高,为94.63%;EcAQP11与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,为81.47%。为验证水通道蛋白的功能,利用RNA干扰技术特异性沉默EcAQP4和EcAQP11基因,结果显示,碳酸盐碱度胁迫后,注射干扰后的脊尾白虾死亡率显著升高,EcAQP4干扰组72 h死亡率达到45%,EcAQP11干扰组72 h死亡率达到55%,与对照组差异显著(P<0.05)。同时发现,EcAQP4干扰组在碳酸盐碱度胁迫24、48与72 h时的血液渗透压变化幅度显著高于对照组(P<0.05),72 h时渗透压显著升高(P<0.05);EcAQP11干扰组血液渗透压在3个时间点均显著升高(P<0.05)。以上结果表明,水通道蛋白在脊尾白虾应对碱度胁迫过程中起到了调节渗透压、维持体内外离子平衡的作用。     

传染性胰腺坏死病毒VP3基因的分段表达及其抗原表位区域分析

采用PCR方法克隆了传染性胰腺坏死病毒(IPNV) VP3四段相互重叠的基因片段L1、L2、L3和L4,将PCR产物分别连接到原核表达载体pGEX-6P1和pET32a上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pGEX-6P1 -VP3(L1)、pET32a-VP3( L2)、pGEX-6P1-VP3( L3)和pGE...     

鲢IL-8基因的克隆与表达分析

采用RACE-PCR方法,从鲢(Hypophthalmichthys molitrix)头肾SMARTcDNA中获得了679 bp IL-8 cDNA序列。结果显示:该序列包含169 bp的5′非编码区,213 bp 3′端非编码区和297 bp的开放阅读框;鲢IL-8的开放阅读框编码98个氨基酸残基,其中包含构成两对二硫键的4个保守半胱氨酸。RT-PCR结果显示鲢:IL-8 mRNA主要在胰、肝脏和头肾中表达。将鲢IL-8不含信号肽的成熟多肽克隆到原核融合表达载体pQE30上,转入大肠杆菌M15内进行表达,经SDS-PAGE电泳后显示,重组融合蛋白在分子量约11kD处有一明显表达带,与预期计算的分子量大小相一致。     

斜带石斑鱼生长激素cDNA克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA文库,克隆了其生长激素(GH)全长cDNA。斜带石斑鱼GH全长cDNA为955bp,编码的多肽为204aa。应用PCR方法把编码GH成熟肽的cDNA片段克隆到表达载体pET-15b,在大肠杆菌BL21(DE3)表达N端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.4mmol·L-1IPTG诱导表达的蛋白约为24kDa,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于6mol·L-1盐酸胍后,用Ni2+-NTA树脂进行亲和分离纯化,纯化产物在SDS-PAGE上表现为一条24kDa的蛋白带。在黑鲷GH放射免疫分析系统中,纯化产物能与黑鲷GH竞争结合GH抗体,表明大肠杆菌表达的斜带石斑鱼GH融合多肽具有GH免疫活性。     

刺激隐核虫小GTP酶Ran基因的克隆与表达

对刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的小GTP酶Ran基因(Ci Ran)进行研究,以期为刺激隐核虫病原生物学研究及其防治提供理论基础。从刺激隐核虫滋养体/包囊前期cDNA文库中筛选出Ci Ran基因的克隆,利用生物信息学方法对CiRan基因及其编码的蛋白进行结构与功能的预测;通过逆转录PCR检测CiRan的mRNA。结果表明其在刺激隐核虫的各个发育阶段均有表达。对CiRan基因开放阅读框内的非通用密码子进行改造,并构建重组质粒p GEX-4T-1/CiRan,将其转化到大肠杆菌(E.coli)后成功表达分子量为51.3 kD的重组融合蛋白rCiRan。用rCiRan蛋白免疫鼠血清进行免疫印迹分析,结果表明,抗rCiRan血清能识别刺激隐核虫各期虫体的天然CiRan蛋白,其表观分子量为25.3 kD,与根据编码基因序列推测出的理论值相符;以rCiRan的抗血清做间接免疫荧光抗体实验,结果表明天然CiRan蛋白在幼虫的细胞质和细胞核内均有分布,且在核膜周围富集,佐证了该分子潜在的功能。     

Influence of different dietary amino acid patterns on growth and body composition of juvenile Japanese flounder, Paralichthys olivaceus

A feeding trial using five semi-purified diets (50% crude protein) was conducted to investigate the effects of different dietary amino acid patterns on growth and body composition of juvenile Japanese flounder. The control diet contained casein and gelatin as intact protein sources and four other diets contained 30% casein–gelatin (2:1, w/w) and 20% crystalline amino acids (CAA). CAA were added to the diets to simulate the amino acid pattern found in red sea bream egg protein (REP), Japanese flounder larvae whole body protein (FLP), Japanese flounder juvenile whole body protein (FJP), and brown fish meal protein (BFP), respectively. The test diets were fed to triplicate groups of juveniles (2.75±0.05 g) twice a day for 40 days to evaluate weight gain, survival, feed conversion efficiency (FCE), protein efficiency ratio (PER), and apparent protein utilization (APU). The apparent retention of total dietary amino acids in the whole body and A/E ratios of the whole body were also evaluated. The highest weight gain was observed in fish fed the diet containing the dietary amino acid pattern of BFP followed by fish fed the control, FJP, FLP and the REP diets. Percent survival, FCE, PER and APU were also significantly (P<0.05) affected by the amino acid pattern in the diets, indicating the highest value in fish fed the BFP diet. Except for a few amino acids, the amino acid composition of the whole body did not show marked differences with different dietary amino acid pattern. Results suggest that BFP could be more suitable as a reference amino acid pattern in the diet of juvenile Japanese flounder compared to the amino acid pattern of FLP, FJP or REP.     

大口黑鲈两种脂蛋白脂肪酶基因cDNA的克隆及表达特征分析

为促进肉食性鱼类人工配合饲料开发的理论基础研究,分析鱼类脂肪代谢的机制,实验克隆了大口黑鲈2个脂蛋白脂肪酶基因LPLtype1和LPLtype2的cDNA。序列分析表明,LPLtype1基因cDNA序列全长2 156 bp,编码516个氨基酸;LPLtype2基因cDNA序列全长1 710 bp,编码346个氨基酸。大口黑鲈LPLtype2与LPLtype1氨基酸序列之间的同源性为43.5%。系统进化分析表明,大口黑鲈LPLtype1和鳜LPL聚为一支,大口黑鲈LPLtype2和大麻哈鱼LPLtype2紧密聚为一支。预测分析发现,大口黑鲈LPLtype1和LPLtype2基因编码蛋白的活性中心位点、N-糖基化位点、二聚体形成的保守疏水残基位点、肝素结合域等主要功能域与硬骨鱼类和其他脊椎动物对比都比较保守。运用实时定量PCR方法检测脂蛋白脂肪酶mRNA的组织分布,发现LPLtype1和LPLtype2都在肝脏中表达量最高,推测这与肝脏是最主要的营养诱导性储脂部位有关。     

鲶生长激素基因cDNA的克隆和原核表达

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR扩增并克隆到鲶鱼的生长激素(GH)基因cDNA。分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列,结果显示:鲶鱼生长激素基因的开放阅读框(ORF)包括603个核苷酸;编码200个氨基酸;其中包括22个氨基酸的信号肽和178个氨基酸的成熟肽。把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于8 mol/L尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得分子量为22.5 kD的单一蛋白带。     

cDNA cloning and expression analysis of the myosin heavy chain (MYH) gene of the mandarin fish Siniperca kneri

In this study, we applied RT-PCR and cDNA cloning techniques to clone myosin heavy chain (MYH) cDNA from muscle tissues of the mandarin fish Siniperca kneri . The cDNA was determined to be of 6987 base pairs in length, encoding a peptide of 1937 amino acids (Genbank accession no. EF446616). A search of encoded protein sequences in the NCBI conserved domain database indicated the presence of all known protein domains for MYH proteins, i.e. the myosin motor domain in the N-terminal region, the DIL domain at the C-terminus, and the ATPase domain. The MYH gene and its protein were expressed predominantly in muscle tissues and weakly in cardiac tissues. Developmentally, the MYH gene was first expressed in the muscle formation stage and continued later on. Our work provided a novel mypsin heavy chain gene sequence in fish biology and the results indicate that the MYH gene and the protein it encodes are important for the growth and development of the mandarin fish, as well as its muscle characterization.     

鲑鱼甲病毒E1基因高保守区融合表达及免疫特性的分析

根据Gen Bank中公布的鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)SAV 1、SAV 2和SAV3三个基因型中E1基因,选择高保守序列702 bp(436-1137)合成基因,命名为SAV E1,将其克隆到原核表达载体p Cold TF中构建重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中,经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western blot鉴定,重组蛋白均获得了表达,表达E1重组蛋白约95 k D。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,制备抗血清。间接ELISA结果显示,鼠抗重组蛋白E1血清效价为1∶25 600;间接免疫荧光结果显示,鼠抗重组E1蛋白血清可与SAV发生特异反应,由此表明表达的E1重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为SAV检测方法的建立提供理论依据。