干扰素-γ研究进展

γ-干扰素(interferon,IFN)是调控天然免疫与细胞免疫的一种重要细胞因子,在抵抗病毒入侵和细菌感染中发挥重要作用。该研究从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏组织中扩增到γ-干扰素基因的cDNA,大小为621 bp,编码206个氨基酸。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼γ-干扰素分子(On IFN γ)具有信号肽、IFN特征序列及核定位信号。预测的三级结构与人类IFN γ晶体结构最相似。qPCR检测显示,IFNγ在正常鱼体内的脾脏中表达量最高,其次是肠、鳃和肾脏。感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后,On IFN γ在脾脏、肾和鳃中的表达均显著上调(P < 0.05)。On IFN γ在相关免疫器官中的高表达、受感染后的表达上调,说明其在罗非鱼免疫防御中可能具有重要作用。该研究为进一步开展On IFN γ基因的功能研究、探讨其在抗病转基因及抗病选育中的开发应用奠定了基础。

     

尼罗罗非鱼补体C9基因的克隆和组织表达分析

为了探究补体C9在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫中发挥的作用,本研究克隆并分析了尼罗罗非鱼补体C9基因(OnC9)。结果显示:OnC9的cDNA序列全长2 502 bp,包含1 761 bp的开放阅读框(ORF),编码586个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,OnC9与牙鲆(Paralichthys olivaceus)补体C9氨基酸相似性最高,达73.0%,与其他鱼类补体C9的相似性介于49.3%~71.4%之间。实时荧光定量PCR检测结果表明,OnC9基因在所检测的各个组织或器官中表达水平有明显差异,在肝脏中表达量最高,其次是肠道、后肾、皮肤、肌肉、鳃,在脑、脾脏、心脏、头肾、胸腺和血液中表达量最低。在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染鱼体后,肝脏、后肾等组织中OnC9表达量表现为在感染12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出现三个峰值的波动表达的规律。说明OnC9在无乳链球菌感染尼罗罗非鱼后的免疫应答中发挥作用。     

尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因的克隆、表达及多态性分析

为进一步了解鱼类MHC ⅡA基因的特点及其在免疫反应中的功能,采用同源克隆、RACE-PCR、巢式PCR等技术,从健康的尼罗罗非鱼体获得1 205 bp的MHC ⅡA基因cDNA全序列(Orni-DBA-0101,Genebank登录号:JF719813)及1 388 bp的基因组序列。序列分析发现,尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因含4个外显子和3个内含子,开放阅读框长720 bp,编码239个氨基酸。从4尾尼罗罗非鱼中共得到8条不同的cDNA序列,分别编码不同的氨基酸序列。氨基酸序列比对后发现,序列间存在丰富的多态性,且主要集中在α-1区,多态性位点数远远高于半滑舌鳎MHC ⅡA基因。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼MHC ⅡA编码的蛋白质分子包含1个信号肽、2个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区,存在4个保守的半胱氨酸残基以及丰富的磷酸化位点,与其他物种的相似性为23%～65%。RT-PCR结果表明,MHC ⅡA基因在脾、肾、肠、鳃、性腺、肝、心脏表达量很高,在鳔和肌肉中表达量最低。人工感染嗜水气单胞菌后,肝、脾、肾、鳃、肠5个组织中MHC ⅡA基因的mRNA水平均发生了不同程度的变化,提示MHC ⅡA分子作为一种重要的免疫因子,在清除病原的免疫反应中起着重要作用。     

尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白的基因克隆及组织表达分析

克隆尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白(On-ECdh)基因,分析On-ECdh基因生物信息学特征及其在正常和无乳链球菌刺激后的尼罗罗非鱼组织中的表达情况.设计基因特异引物扩增On-ECdh基因片段,采用生物信息学对其序列进行分析,利用荧光定量PCR技术检测On-ECdh基因的表达模式.On-ECdh基因开放阅读框为2442 b...     

尼罗罗非鱼MHC Іα全长cDNA的克隆、多态性及组织表达特征

通过同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,, 获得尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的MHC Іα全长cDNA,, 分析其多态性和组织表达特征。获得的尼罗罗非鱼MHC Іα cDNA全长为1 533 bp, , 其ORF为1 053 bp。编码的蛋白质分子包含信号肽、MHC结构域、IGc1结构域和跨膜区,, 并存在丰富的磷酸化位点。与其他硬骨鱼类和哺乳类的相似性在26.86%~74.0%。从6尾鱼中共分离得到6条不同的MHC Іα cDNA序列,, 其序列中存在多个单核苷酸多态性位点,, 说明MHC Іα cDNA存在丰富的多态性。qPCR检测表明,, MHC Іα基因在脾和心中表达量较高,, 中等程度表达于鳃、肠和肾中,, 在脑、肝、胃、皮肤和肌肉中表达量较低。对尼罗罗非鱼进行人工感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后,, MHC Іα基因的mRNA表达水平在鳃、肾、心脏和脾4个组织中均发生了不同程度的变化。结果表明MHC Iα基因参与罗非鱼免疫反应,, 在免疫应答中发挥重要功能。本研究通过研究尼罗罗非鱼MHC Іα的生物学活性、功能和表达调控,, 旨在为揭示尼罗罗非鱼免疫抗感染机制提供基础资料,, 并为利用MHC Іα作为候选基因筛选尼罗罗非鱼抗病相关分子标记、辅助抗病品系的选育奠定基础。

     

尼罗罗非鱼Siglec-4b like基因的克隆与表达特性分析

从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)嗜中性粒细胞中克隆了唾液酸结合型免疫球蛋白凝集素 Siglec-4b like基因,对其进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测：1)早期胚胎发育过程的表达;2)成鱼组织中的分布;3)人工感染无乳链球菌（Streptococcus agalactiae, GBS）后组织表达的变化。结果表明,尼罗罗非鱼Siglec-4b like具有与哺乳类Siglec-4相似的特异性结构域及保守氨基酸残基;早期胚胎发育Siglec-4b like基因在卵子中有一定表达量,受精后7 h 即卵裂期表达上调,随后表达下降;Siglec-4b like基因在所检测的各组织中均有表达,鳃的表达量最高,其次是肌肉、皮肤、头肾和肠,其他组织的表达量较低;人工感染无乳链球菌后,Siglec-4b like在鳃、肾与肠等多个组织的表达均呈下调趋势。研究结果为进一步开展Siglec-4b like对罗非鱼免疫系统的调控作用及其与无乳链球菌免疫逃逸机制关系的研究奠定基础。     

尼罗罗非鱼Xbp1-S基因克隆及表达分析

为了了解尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)细胞转录因子Xbp1-S(On Xbp1-S)的基因序列特征及其在无乳链球菌(Streptococcus alactolyticus)应激和在B细胞分化中的作用,应用RACE克隆技术获得的On Xbp1-S基因全长1380 bp,包括开放阅读框ORF为1155 bp,5?端非编码区(5?UTR)长127 bp,3?端非编码区(3'UTR)长98 bp。On Xbp1-S序列分析推测该基因编码384个氨基酸,分子量为41.32 k Da,理论等电点为4.36。同源性分析显示,On Xbp1-S基因与其他鱼类的聚为一支,其中,与南极鳕(Notothenia coriiceps)相似性最高。荧光定量PCR及Western-blot结果显示,On Xbp1-S在各组织中均有表达,m RNA水平上在肝脏中表达量最高,蛋白水平上在胸腺中表达量最高,而在肌肉中表达量最低。无乳链球菌应激后,On Xbp1-S基因在肝脏和脾脏中的表达趋势相似,均在应激期间出现表达量上调,在192 h出现峰值。另外,免疫组化分析发现,On Xbp1-S因子在不同分化程度B细胞亚类中的表达呈现差异,在成熟B细胞中呈现高表达,而在未成熟B细胞中几乎不表达。研究结果表明,On Xbp1-S参与尼罗罗非鱼对无乳链球菌的免疫防御,和在B细胞分化中起作用。本研究将为进一步研究On Xbp1-S因子应答病原菌侵染的机理及促进B细胞分化机制提供理论依据。     

尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰb)基因3′cDNA末端克隆及序列分析

为探讨尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代(Oreochromis niloticus ♀× Sarotherodon melanotheron ♂)IGF-Ⅰ基因结构差异,研究IGF-Ⅰ基因与此3种基因型罗非鱼耐盐性能差异之间的关系,通过3′-RACE的方法,从鳃的总RNA分别获得其IGF-Ⅰb基因的部分cDNA序列,长度分别为1076bp、1075bp和1079bp,包含完整的开放阅读框(ORF)546bp、一个终止密码及含polyA信号的3′UTR;ORF编码182个氨基酸,包括信号肽(44aa),成熟肽B区(29aa)、C区(10aa)、A区(21aa)、D区(8aa)及编码70aa的E区,二级结构为混合类型;与其他脊椎动物IGF-Ⅰb序列的序列相似度达75.8%～100%;成熟肽A、B区高度保守,C区第82位后缺失2aa,E区第131位和159位分别缺失3aa和1aa;萨罗罗非鱼在E133位发生Ala/Pro氨基酸残基替换,与耐盐性强的莫桑比克罗非鱼和画眉罗非鱼一致,推测IGF-Ⅰb基因E区选择性剪切与3种罗非鱼耐盐性能差异有关。     

尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代胰岛素样生长因子(IGF-Ib)基因3'cDNA末端克隆及序列分析

为探讨尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代(Oreochromis niloticuss♀×Sarotherodon melanotheron ♂)IGF-I基因结构差异,研究IGF-I基因与此3种基因型罗非鱼耐盐性能差异之间的关系,通过3'-RACE的方法,从鳃的总RNA分别获得其IGF-Ib基因的部分cDNA序列,长度分别为1 076 bp、1075 bp和1 079 bp,包含完整的开放阅读框(ORF)546 bp、一个终止密码及含polyA信号的3'UTR;ORF编码182个氨基酸,包括信号肽(44aa),成熟肽B区(29aa)、C区(10aa)、A区(21aa)、D区(8aa)及编码70aa的E区,二级结构为混合类型;与其他脊椎动物IGF-Ib序列的序列相似度达75.8%-100%;成熟肽A、B区高度保守,C区第82位后缺失2aa,E区第131位和159位分别缺失3aa和1aa;萨罗罗非鱼在E133位发生Ala/Pro氨基酸残基替换,与耐盐性强的莫桑比克罗非鱼和画眉罗非鱼一致,推测IGF-Ib基因E区选择性剪切与3种罗非鱼耐盐性能差异有关.     

奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)MyoD1和MyoD2基因全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090bp,包括5′非翻译区(UTR)137bp,3′UTR50bp,开放阅读框(ORF)903bp,编码300个氨基酸,其中第110～161个氨基酸为bHLH结构,第233～249个氨基酸为helixIII结构;MyoD2全长均为1478bp,包括5′UTR215bp,3′UTR471bp,ORF792bp,编码263个氨基酸,其中第91～142个氨基酸为bHLH结构,第212～228个氨基酸为helixIII结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%～92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%～79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支,MyoD1所反映的不同鱼类间的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼[Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus(♀)]进行鉴定。结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。该研究为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。     

不同盐度下尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼和以色列红罗非鱼幼鱼生长、成活率及肥满系数的差异

用1m×1m×1m的实验网箱,在盐度分别为0、10、20及30的水体中进行尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、萨罗罗非鱼(Sarotherodonmelanotheron)和以色列红罗非鱼(Israeliredtilapia)幼鱼的养殖实验。结果表明:(1)盐度、鱼的种类及盐度-鱼类的交互作用都对3种罗非鱼的生长及体重变异系数有显著影响(P<0 05);3种罗非鱼的成活率和肥满系数只受鱼的种类影响(P<0 05);盐度、盐度-鱼类的交互作用对其都无显著影响。(2)生长和盐度之间的回归关系在尼罗罗非鱼和以色列红罗非鱼较显著,在萨罗罗非鱼显著性较差。(3)尼罗罗非鱼和以色列红罗非鱼的生长随着盐度的降低而加快,萨罗罗非鱼的生长随着盐度的降低而减慢。在3种鱼中,盐度在6 9以下时,尼罗罗非鱼生长最快;盐度7 4～28 7时,以色列红罗非鱼生长最快;盐度高于29 0时,萨罗罗非鱼生长最快。(4)在实验的4种盐度下,萨罗罗非鱼的成活率都高于以色列红罗非鱼和尼罗罗非鱼,而除了在淡水中外,以色列红罗非鱼的成活率又都高于尼罗罗非鱼;萨罗罗非鱼的肥满系数都显著高于尼罗罗非鱼和以色列红罗非鱼,而以色列红罗非鱼的肥满系数和尼罗罗非鱼的没有显著差异。     

尼罗罗非鱼微阵列Fosmid基因组文库的构建及基因筛选

以pCC2FOS为载体构建尼罗罗非鱼Fosmid基因组文库,共挑选115 200个单菌落,保存在300块384孔样品板中,构建4 800个行池、7 200个列池、300个板池和25个超级池,形成微阵列,并对其进行复制备份。该文库插入片段平均长度约为40 kb,覆盖约罗非鱼基因组的3倍。连续传代实验研究表明,文库具有良好的稳定性。由于构建超级池－板池－行、列池三级池系统形成的微阵列,有助于快速、准确、有效地筛选目的基因,仅需77个PCR反应(超级池25 板池12 行池16 列池24)就能筛选到含有目的基因的一个单克隆,解决了普遍存在的文库筛选难题。通过文库尝试筛选18个与性别分化和生长相关基因,均获得2~5个阳性克隆,说明文库具有较好的实用性。     

尼罗罗非鱼雌雄鱼肌肉组织差异表达基因的筛选

应用引物退火控制技术(ACP)筛选尼罗罗非鱼雌雄鱼肌肉组织差异表达基因,寻找与雌雄鱼肌肉生长发育相关的候选基因。本实验从同等条件下养殖的尼罗罗非鱼群体中随机选取雌、雄鱼各5尾组成RNA池,采用引物退火控制技术,分析了两组个体肌肉组织差异表达基因。利用20对随机引物差异显示扩增,共获得8条ESTs,其中5个已知的ESTs分别为转录变体3(LOC100691543)、60S核糖体蛋白(RL3)、小白蛋白β样蛋白、肌型肌酸激酶M2-CK和转录因子Sox4,其余3个为未知的ESTs。实时定量PCR分析各差异表达基因在尼罗罗非鱼雌雄肌肉组织中的表达发现,8个差异表达基因中转录变体3与ACP6-Y在尼罗罗非鱼雄鱼肌肉组织中的表达均极显著高于雌鱼(P0.01),ACP3-X、60S核糖体蛋白(RL3)、小白蛋白β样蛋白、ACP15-X、肌型肌酸激酶M2-CK与转录因子Sox4在尼罗罗非鱼雌鱼肌肉组织中的表达均极显著高于雄鱼(P0.01)。结果表明,应用引物退火控制技术筛选获得了8个可能参与了雌雄鱼肌肉生长发育调控的ESTs,为进一步筛选雌雄鱼肌肉生长发育相关候选基因奠定了基础。     

尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白及其美拉德反应产物成分分析

利用氨基酸自动分析仪及气-质联用仪对尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白进行了分析。结果表明,甘氨酸占氨基酸总量的30．48％,脯氨酸和羟脯氨酸（Hyp）的含量也较高,为胶原蛋白特有氨基酸。此外还鉴定出15种风味成分,主要化学成分为5－甲基呋喃醛、5－甲基－2－呋喃甲、1－甲基－4－（1－甲乙基）－1,4－环己二烯等。     

黄鳍鲷和尼罗罗非鱼鳃丝表面结构扫描电镜观察

黄鳍鲷Sarus latus和尼罗罗非鱼Oreochromis nilotica鳃丝和鳃小片表面都具有规则或不规则分布的环形微嵴、沟状或坑状凹陷及孔洞等结构.黄鳍鲷的鳃丝表面一部分鳃丝表皮凹凸不平,另一部分鳃丝表皮较为平坦.黄鳍鲷和尼罗罗非鱼鳃上皮几种细胞的形态结构及数量分布存在细微的差异.黄鳍鲷的扁平上皮细胞表面观以不规则的六边形为主,或类似菱形的四边形,细胞间界限清楚,而尼罗罗非鱼鳃丝细胞表面的微嵴以形成密集指纹状回路,隆起的微嵴两侧有细小的横突,扁平上皮细胞间排列凹凸不平,形成深沟或凹坑,成为细胞间明确的界线.黄鳍鲷鳃丝表面的氯细胞和粘液细胞数量较多,尼罗罗非鱼鳃丝表面基本上没有观察到氯细胞,粘液细胞很少.黄鳍鲷鳃小片的厚度比尼罗罗非鱼鳃小片的厚.     

奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2特征及差异

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) MyoD1和MyoD2 全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090 bp,包括5′ 非翻译区 (UTR) 137 bp,3′ UTR 50 bp,开放阅读框 (ORF) 903 bp,编码300个氨基酸,其中第110~161个氨基酸为bHLH结构,第233~249个氨基酸为helix III结构;MyoD2全长均为1478 bp,包括5′ UTR 215 bp,3′ UTR 471 bp,ORF 792 bp,编码263个氨基酸,其中第91~142个氨基酸为bHLH结构,第212~228个氨基酸为helix III结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%~92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%~79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支, MyoD1所反映不同鱼类的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2 cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长,差异明显。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼 [Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus (♀)]进行鉴定,结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。这为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。     

尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼及其正反杂交后代的微卫星分析

微卫星（microsatellite）技术是近年来广泛应用的DNA标记,具有重复性好、较易操作和共显性的特点。在硬骨鱼类中表现出高度多态性,已在家系鉴定、遗传作图、群体遗传分析、育种以及系统发生研究等多个领域得到应用。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是我国主要淡水养殖鱼类,生长快,耐盐能力一般;萨罗罗非鱼（Sarotherodon melanotheron）耐盐能力强,适合咸淡水养殖,但生长较慢。[第一段]     

尼罗罗非鱼与莫桑比克罗非鱼的含肉率及鱼肉的生化分析

<正> 鱼的含肉率及其营养成分是评价鱼类质量高低的指标之一。为此,我们从1979年开始,连续两年进行了尼罗罗非鱼和莫桑比克罗非鱼含肉率的测定及鱼肉的生化分析,其目的是比较这两种鱼的经济价值。材料和方法材料分别取自1979年10月和1980年10月     

尼罗与奥利亚罗非鱼对池塘蓝藻水华及水质影响的研究

利用尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼进行了池塘抑藻试验,采用血球计数板测定水体中的微囊藻密度,并对水体理化性质进行了检测分析。试验结果表明,罗非鱼能有效消减水体中蓝藻生物量,降低水体藻毒素浓度,并对水体TN、TP产生一定影响。其中奥利亚罗非鱼试验组蓝藻初始密度为1．53-108cells／L,下降至0．86-108eells／L,降低43．79％;尼罗罗非鱼组蓝藻初始密度为1．54-108cells／L,下降至O．51×108cells,L,降低66．88％。水体总磷含量无显著变化,总氮含量有所下降,水体微囊藻毒素MC—LR含量随着蓝藻密度的下降而降低,并讨论了尼罗与奥利亚罗非鱼摄食抑制蓝藻的摄食抑制及其对水质的影响。     

尼罗罗非鱼p38MAPK基因克隆与表达分析

为了探究p38MAPK与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫功能的相关性,本实验运用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得尼罗罗非鱼埃及品系ntp38MAPK的cDNA全长序列,结果显示,该序列全长1789 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长1086 bp,5′非编码区(Untranslated Region,UTR)长342 bp,3′UTR为361 bp。ORF编码361个氨基酸,预测分子量为41.598 kD,理论等电点为5.10。序列含有p38家族典型保守的Thr-Gly-Tyr(TGY)双磷酸化位点以及紧密相连的底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)。同源性以及系统进化树分析结果显示,尼罗罗非鱼的p38MAPK与大黄鱼(Larimichthys crocea)和鲈(Dicentrarchus labrax)的相似性最高。采用qRT-PCR的方法研究了ntp38MAPK在各组织以及无乳链球菌感染过程中的表达差异情况,结果显示,ntp38MAPK在各组织均有表达,其中在肌肉的表达量最高,心脏、肝脏、脾脏次之,头肾中的表达量最低。无乳链球菌感染过程中,脾脏、头肾中ntp38MAPK的表达量在2 h开始上调,肝脏中4 h开始上调,8 h后肝脏、脾脏和头肾中的表达量都有所下降,24~72 h趋于平稳,表明ntp38MAPK在尼罗罗非鱼抵抗链球菌侵染过程中发挥重要作用。