根癌农杆菌介导ACS反义基因转化香蕉的研究

以香蕉(Musa spp.)品种‘天宝蕉’(Musa spp.,AAA类群)为试材,对以根癌农杆菌介导法的香蕉遗传转化体系进行较全面的研究,并以该系统进行了ACS反义基因转化香蕉的研究。结果表明:不经预培养的香蕉茎尖横切薄片,侵染前用附加0.1 mg/L甘露醇的高渗固体培养基前处理4 h,农杆菌重悬液浓度为OD600在1.0左右,重悬液中含100 g/L蔗糖,接菌时间为10~15 min,于26℃黑暗条件下共培养4 d,共培养培养基pH值为5.8是较为适合的转化条件;采用附加100 mg/L卡那霉素、2 mg/L AgNO3筛选培养基对共培养后的香蕉横切薄片进行筛选,共获得5个转ACS反义基因的抗性芽系;经GUS组织化学法及PCR检测,gus基因已整合进香蕉基因组。     

农杆菌介导SlNAC1基因转化棉花的研究

本实验在无菌条件下,以棉花下胚轴为外植体,利用农杆菌介导转化番茄SlNAC1基因,通过愈伤组织培养、分化及PCR检测棉花幼苗获得了T0代的阳性转基因棉花植67株.     

发根农杆菌介导抗菌肽Shival基因转化马铃薯的初步研究

利用已构建载体530 Shiva,转化马铃薯普通栽培种甘农薯1号、澳布、HLS和夏波蒂的试管苗及块茎盘的研究.结果表明,以Kan 50 mg·L-1和100 mg·L-1作为筛选转基因细胞和植株的剂量.对于发根农杆菌侵染马铃薯试管苗应采用新鲜菌落直接涂抹伤口进行侵染,这种方法诱导生根率高且易于操作,根诱导率、成愈率及分化率远高于浸泡法;发根农杆菌转化试管苗,后期愈伤组织分化产生5个幼苗.发根农杆菌菌液侵染甘农薯1号和夏波蒂两品种的块茎盘,7 d后就有很小的毛状根突起产生,2周后即有大量毛状根产生,3周后毛状根产生量有所减少,产生的毛状根3周时其成愈率分别为31.0%和27.0%,愈伤组织分化成苗比较困难,分化出3个幼苗,分化率分别为6.45%和3.70%.转化材料进行冠瘿碱检测表明,分化苗均为胭脂碱阳性反应.环腐病菌接种试管苗结果表明,分化植株与对照相比抗性明显增强.     

影响农杆菌介导的大豆基因转化因素的研究

通过农杆菌介导法用含NPT－Ⅱ和Barnase基因导入到大豆幼胚，大豆子叶节叶，然后经过含Kan的筛选培养基中连续筛选，获得一批Barnase转基因植株。经PCR扩增结果，证实此基因已整合到大豆中，在当代植株中生物学特性观察，花粉粒不育率在98％。     

农杆菌介导glgC-TM基因转化水稻研究

 利用农杆菌介导将glgC-TM基因导入多个水稻品种。研究表明农杆菌转化过程中，潮霉素是一种很好的筛选剂，成熟胚以及国产的羧苄青霉素不适宜用作农杆菌介导的遗传转化。不同品种以及不同的质粒在转化过程中对抗性愈伤的得率和阳性植株的转化率不存在显著影响。T1代PCR检测表明，在转基因当代就有可能获得转基因纯系。     

农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化影响因子的研究

用大豆体细胞胚为外植体,以抗性体细胞胚筛选率为转化率的指标,研究了农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化系统的几种影响因子.结果表明,用球形期的体细胞胚受伤处理作为转基因的受体、预培养1.5天有利于转化;筛选不同的代数,转化率在3个月以前明显下降,而在3个月以后则基本稳定在8%左右.     

农杆菌介导的大豆植株整体转化

农杆菌介导的植物整体转化法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导人的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代.以大豆幼苗的顶端生长点和叶腋生长点为靶点,通过农杆菌介导的整体转化法--注射法进行转录因子DREB1C基因的遗传转化,最终获得6株T0代PCR阳性转基因植株,转化率为9.2%.T1代植株的PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定结果表明获得1株阳性植侏,DREB1C基因以单拷贝形式整合于大豆基因组中,在200 mmol·L-1NaCl胁迫条件下在转录水平得到成功表达.该方法克服了大豆组织培养再生难、转化率低的缺点,是一种高频、简单、快捷的非组培遗传转化途径.     

农杆菌介导甘蔗基因转化技术的优化

以甘蔗（Saccharum officinarum L.）品种ROC10为转化受体材料,以GFP基因为报告基因,通过对农杆菌介导遗传转化的一系列条件,包括农杆菌菌株及侵染菌液浓度、侵染时间、受体愈伤组织龄期、AS活化时间及使用浓度、共培养时间等进行优化,同时进行了便于vir基因活化和T-DNA转移的条件组合,如附加果糖和葡萄糖、酸性环境感染,低温共培养等,从而建立了一个可行、有效而又简便的农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系。结果表明:农杆菌菌株EHA105优于LBA4404,其适宜侵染浓度D600为1.3752;适宜受体愈伤组织龄期为25℃暗培养25d;适宜侵染时间为30min;适宜AS活化时间为2h,使用浓度为200μmol·L-1;适宜共培养时间为4d。获得2株有荧光信号的植株,对这2株植株进行斑点Southern杂交检测,均有阳性反应,证明GFP基因已整合到甘蔗基因组中并得到了有效表达,表明该转化体系确实是有效的。      

农杆菌介导的大豆遗传转化研究进展

植物基因工程是大豆遗传改良的重要途径。农杆菌介导法是大豆遗传转化的重要方法之一,许多实验室应用该方法得到了转基因大豆,但目前使用该方法进行转化的效率还比较低,尚需深入研究。综述了农杆菌介导的大豆遗传转化的分子机理,常用转化体系及其优缺点并分析了影响转化效率的因素,同时对今后研究的重点进行了讨论。     

影响农杆菌介导大豆子叶节遗传转化因素的研究

利用GUS基因的稳定性和特异性及在植物体中瞬时表达的特点,对农杆菌介导大豆子叶节遗传转化过程中的一些影响因素(激素浓度、筛选剂浓度、基因型和农杆菌菌株)进行研究.结果表明:芽诱导阶段6-BA浓度为1.6mg· L-1时诱导效率较高;适宜的草铵膦筛选浓度为3 mg· L-1;同时对24个大豆基因型的再生能力和对农杆菌菌株...     

根癌农杆菌介导的高粱遗传转化体系的建立

用高粱幼穗诱导的愈伤组织与农杆菌共培养,成功地实现了农杆菌介导的高粱遗传转化,并筛选得到了转基因再生植株.经过PCR和Southern杂交,均已证实了外援基因已导入和整合到植物体中.得到的部分转基因植株,经过抗虫鉴定表明,具有很强的抗虫性.高粱遗传转化过程中最佳预培养时间是3～5 d,最适宜的菌液浓度为OD600值＝0.5～0.7,共培养培养基的最佳pH值是5.2～5.6,最佳温度为22～25 ℃,最佳共培养时间是3 d.100 μmol/L乙酰丁香酮对提高高粱愈伤组织遗传转化有非常显著的效果.     

利用农杆菌介导法进行亚麻转基因的培养基研究

本试验以亚麻幼苗的下胚轴为外植体进行了卡那霉素选择压力的试验。确定5 0mg/L为适宜的选择压力。同时采用农杆菌介导法 ,利用EHA1 0 5菌株进行了亚麻转基因适宜培养基筛选试验。经试验认为MS培养基是亚麻转基因的适宜培养基。在附加IAA3.5mg/L、KT2mg/L、LH1 5 0mg/L的MS选择培养基上转化外植体的愈伤组织的诱导率可达 77.4%。     

亚麻转基因植株的再生及生根培养的研究

本试验以亚麻幼苗的下胚轴为外植体 ,利用抗除草剂 Basta的目的基因和 GUSINT基因 ,采用农杆菌介导法进行了亚麻转基因过程中植株再生及生根适宜培养基的筛选试验。经试验得出 :在附加少量 BA和 NAA的 Ms培养基上愈伤组织的再分化率可达31.8%～ 40 .2 %。经 GUS基因检测在脱菌后 3天亚麻下胚轴初步形成的愈伤组织的转化率可达 72 .2 %;四周后的转化率为 2 5 %;再生植株的转化率为 2 0 %。在 1/2 Ms培养基中附加 0 .0 0 1mg/L NAA可使再生植株的生根率达到 87.4%。通过试验初步建立起了根瘤农杆菌介导法亚麻转基因系统。     

农杆菌介导的马铃薯遗传转化影响因素研究进展

从基因型、外植体种类、预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、选择压、培养基激素含量等方面综述了农杆菌介导的马铃薯遗传转化的影响因素,并对进一步的研究进行了展望,以期该技术在马铃薯的产量提高、品质改善中发挥作用。     

农杆菌介导的CyMV-CP基因对石斛遗传转化研究

以本实验室构建的含有建兰花叶病毒外壳蛋白基因(CyMV-CP)的pBI121为表达载体,以继代培养2～3次的石斛类原球茎为转化受体,用农杆菌介导法转化石斛,建立并优化了石斛的遗传转化体系。结果表明:类原球茎经农杆菌菌液(OD600值为1.0)侵染30 min后,24℃培养4 d,用头孢霉素(500 mg/L)脱菌后转接到卡那霉素(150 mg/L)筛选培养基中进行筛选培养;对获得的转CyMV-CP石斛进行PCR和实时荧光定量RT-PCR检测,表明目的基因已经整合到石斛基因组中,并得到表达。所建立的转化体系,受体材料来源丰富、转化过程简单,可重复性强、转化效率高、假阳性少,适合于石斛的遗传转化研究。     

香蕉茎尖遗传转化法研究

通过对多茎尖繁殖方法和转基因研究,建立了香蕉茎尖外源基因的遗传转化方法。明确了卡那霉素或Ｇ－４１８在转化植株中所使用的合适浓度,即当使用卡那霉素时,其产梢的浓度为１００ｍｇ／Ｌ,导根的浓度为１５０ｍｇ／Ｌ;但当使用Ｇ－４１８时,其产梢浓度则为２５ｍｇ／Ｌ其导根浓度则为３０ｍｇ／Ｌ或３５ｍｇ／Ｌ。通过基因枪和农杆菌共培养法尝试将黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白基因转化香蕉组织,其结果表明：经过卡那霉素或Ｇ－４１８的筛选,仅有５％～７％的芽能够存活下来。通过选择性继代培养,最后获得了７３株株转化植株;对其中的２４株进行ＰＣＲ检测,结果表明阳性率达８３．３％;进一步的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明：ＰＣＲ检测阳性的８１．８％植株含有外源衣壳蛋白基因。     

利用GUS基因的瞬时表达优化大豆根癌农杆菌介导的遗传转化

高转化效率是分子育种的重要前提,根癌农杆菌介导的遗传转化由于其有较高的遗传效率和较低的拷贝数成为目前优选方法。为优化大豆遗传转化体系,以本实验室已有转化体系为基础,利用pCAMBIA3301中35S∶GUS基因瞬时表达体系,从萌发时间、切豆方法、侵染时间、共培养方式以及共培养时间等方面对东农47、垦农18和B12088大豆栽培品种的遗传转化体系进行优化。结果表明:东农47萌发1 d,侵染30 min;垦农18和B12088萌发12 h,侵染30 min,GUS基因瞬时表达率最高。在其它的处理上,3个品种表现结果一致,即蘸取菌液切豆,共培养中子叶伤口朝下摆放,黑暗条件下共培养3～5 d,GUS基因瞬时表达最高。3个品种在最适条件下,GUS染色效率均达到90%以上,垦农18遗传转化效率较高。本研究为大豆农杆菌介导子叶节转化方法提供了一个改进的方案,并且为拓宽可利用于大豆遗传转化的种质资源奠定基础。     

根癌农杆菌介导的水稻转化体系

简要回顾了水稻转基因发展的历程;通过农杆菌介导法转化水稻的流程,分析了几种根癌农杆菌介导的目的基因转化水稻的影响因素:农杆菌菌系及Vir基因的活化、水稻基因型和培养基种类、农杆菌侵染外植体的时间、共培养的方式、共培养时间、选择标记与报告基因的选择、选择压;最后提出了水稻遗传转化中存在的问题及解决的方法。