抗稻瘟病新基因被克隆

<正>近日,《细胞研究》在线发表中国工程院院士万建民团队有关水稻抗稻瘟病分子机制的最新进展。他们克隆了调控水稻先天免疫的新基因Os CNGC9,并对其影响水稻苗期稻瘟病抗性的分子机制进行了深入研究。植物主要依靠自身的免疫系统抵御病原的入侵。在模式触发的免疫反应(PTI)中,植物通过定位于细胞膜上的模式识别受体(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMP),从而激活PTI反应。细胞质中钙离子浓度的瞬时上升一直     

水稻OsAMTR310基因的克隆与在干旱胁迫下的功能分析

为了探究水稻转氨酶基因Os AMTR310的功能以及明确其作用机制,利用多种分子生物学手段对Os AMTR310基因进行了功能分析。实时定量PCR的分析结果表明,Os AMTR310在干旱条件下相对基因表达水平是正常条件下的3.0倍;根据NCBI上获得的Os AMTR310基因序列设计引物,扩增其全长CDS序列,并利用NCBI对蛋白序列的功能结构域进行预测;将Os AMTR310的CDS序列连入p CAMBIA1302中构建超表达载体,并转入受体材料,通过PCR及蛋白质免疫印迹分析来确定Os AMTR310阳性转基因植株,进而分析Os AMTR310转基因植株与野生型植株在干旱胁迫下的差异来验证Os AMTR310基因的功能。结果表明,Os AMTR310 c DNA全长1 873 bp,CDS全长1 533 bp,编码510个氨基酸。Os AMTR310蛋白具有3个保守的结构域,属于乙酰鸟氨酸氨基转移酶家族。在正常条件下,Os AMTR310转基因植株与野生型相比没有明显的差别;然而,在干旱条件下,Os AMTR310转基因植株的存活率是野生型的1.5~2.0倍。通过测定叶片游离脯氨酸含量发现,Os AMTR310转基因植株游离的脯氨酸含量在正常条件下与野生型相比并无显著差异,而Os AMTR310转基因植株的游离脯氨酸含量在干旱条件下是野生型植株的1.5~2.0倍,说明水稻转氨酶基因Os AMTR310赋予了水稻更高的耐旱性。     

水稻灌浆期籽粒中光信号相关基因鉴定与表达分析

光是影响水稻生长发育重要的环境因素,光作为信号物质调控水稻众多生长发育过程,但光信号在水稻籽粒灌浆中的作用研究较少。本研究利用高通量测序技术,对水稻灌浆期强、弱势粒中光信号途径相关基因进行了鉴定,从抽穗后10 d、15 d、21 d、27 d和35 d 5个灌浆时期,鉴定出了5个光受体基因,9个光信号途径调控因子基因,8个光信号途径其他基因共22个光信号相关基因。光受体基因包括光敏色素Os PHYB和Os PHYC,隐花色素基因Os CRY1b、Os CRY2和Os CRY-DASH。Os PHYB和Os PHYC在5个灌浆时期强、弱势粒中均表达;Os CRY-DASH在5个灌浆时期弱势粒中均表达,在强势粒中除21 d外其余4个时期均表达。调控因子基因Os PIL15、Os COP1、Os HY5、Os HFR、Os SPT、Os ELF3-1和Os ELF3-2在5个灌浆时期强、弱势粒中均表达。灌浆期基因表达动态分析表明,光信号途径基因在弱势粒中的表达量高于强势粒,光敏色素基因与调控因子基因之间在灌浆期协同表达。     

胁迫相关蛋白激酶基因OsSAPK2调控水稻抗白叶枯病反应

水稻蔗糖非酵解型蛋白激酶Sn RK2,又称胁迫相关蛋白激酶(stress-activated protein kinase genes in rice,Os SAPKs),在调控水稻非生物胁迫信号传导中起着重要作用。本研究对Os SAPK2的结构及其在水稻抗白叶枯病反应中的功能进行了初步研究。结果表明Os SAPK2被定位于细胞核和细胞质内,与Os SAPK1、Os SAPK3同属于Kulik’s II组。Os SAPK2-RNAi转基因水稻中Os SAPK2下调表达,人工接种水稻白叶枯病菌后,转基因水稻比受体对照的病斑长度显著增长,抗病相关基因Os LRR1、Os HIR1表达水平下降,感病相关基因Os MAPK5表达水平升高。此外,Os SAPK2具有自激活活性,可能与Os MAPK5等胁迫相关蛋白互作。上述结果为进一步研究Os SAPK2调控水稻抗白叶枯病的分子机制提供了信息。     

锌铁转运蛋白基因OsZIP5和OsZIP9参与水稻Zn^2+和Cd^2+的吸收和转运

锌(Zn)和镉(Cd)在水稻中的积累与世界粮食营养健康与安全息息相关。锌和镉具有相似的化学和物理性质,但在高等生物中具有不同的生理效应。在植物中,通过不同基因家族的不同转运蛋白参与锌和镉的吸收或转运。本研究对水稻锌铁转运蛋白(zinc-regulated transporters, iron-regulated transporter-like proteins,ZIPs)基因家族的16个成员进行生物信息学分析,并在锌缺乏或加镉胁迫条件下开展其表达模式分析,探究ZIP基因家族成员在水稻锌和镉吸收及累积过程中可能的生物学功能。研究发现,Os ZIP5和Os ZIP9同时受锌缺乏和镉胁迫的诱导表达。通过异源酵母表达验证了Os ZIP5和Os ZIP9具有Zn^2+和Cd^2+的转运活性,并进一步通过不同时期不同组织的表达模式分析发掘Os ZIP5和Os ZIP9在水稻Zn^2+和Cd^2+吸收或转运中的作用。本研究为水稻ZIP基因家族成员参与Zn2+和Cd2+的吸收和累积的相关研究提供参考。     

OsVPE3参与GA、ABA调节水稻糊粉层细胞程序性死亡的发生

水稻(Oryza sativa L.)糊粉层细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)是水稻种子萌发过程的关键环节,为探究赤霉素(gibberellin acid,GA)与脱落酸(abscisic acid,ABA)在水稻糊粉层PCD中的作用,本研究以水稻"优Ⅱ128"种子为材料,通过采用实时荧光定量PCR技术、荧光染色方法及激光共聚焦扫描显微技术,对Os VPEs表达水平、VPE(vacuolar processing enzyme)活性以及水稻糊粉层细胞存活率等进行测定分析。结果表明:在萌发水稻种子及其胚、糊粉层中,Os VPE3的表达水平都显著高于Os VPE1、Os VPE2和Os VPE4,并且水稻糊粉层中的Os VPE3表达水平及其VPE活性均比水稻种子和胚的高,因此推测水稻糊粉层Os VPE3在水稻种子萌发中可能起着重要的作用。进一步的研究表明,GA显著地提高Os VPE3的表达水平及VPE活性水平,比对照分别提高333%和38%,相应地降低水稻糊粉层中细胞的存活率;而ABA则显著下调Os VPE3的转录水平和降低VPE的活性,分别减少49%和36%,却明显提高糊粉层中细胞的存活率。在ABA中加入GA后,则逆转了ABA的效应。以上结果证实,GA和ABA分别通过Os VPE3促进或抑制水稻糊粉层PCD进程,为进一步研究水稻种子萌发过程糊粉层PCD发生的分子机制提供理论依据。     

3个水稻类病变基因的逆境胁迫及激素响应特征

水稻中已克隆出十几个控制类病变(lesion mimic,LM)性状的基因,其中以SPL(spotted leaf)命名的基因如Os SPL7、Os SPL11、Os SPL28分别编码不同功能的蛋白质。本研究首先分析Os SPL7、Os SPL11和Os SPL28启动子序列,发现均含有大量应答激素和逆境的顺式作用元件,并采用实时定量PCR检测这3个Os SPL基因在水稻不同部位的表达情况,以及逆境和激素等不同处理对它们在转录水平表达的影响。结果表明:Os SPL7、Os SPL11和Os SPL28在不同时期水稻组织中没有明显的时空差异表达;低温、盐、干旱胁迫和ABA、ACC、JA、SA四种激素在转录水平调控Os SPL7、Os SPL11和Os SPL28表达,其中Os SPL7表达受低温、干旱、ACC和JA抑制而受ABA、SA诱导,Os SPL11表达受低温、干旱和JA抑制而受SA显著诱导,Os SPL28表达受到JA强烈抑制而对低温不敏感。研究结果可为进一步研究激素和非生物胁迫调控植物类病变发生的作用机制提供线索。     

水稻葡聚糖内切酶新基因OsGLU16的克隆及特性研究

β-1,4-葡聚糖内切酶(endo-β-1,4-glucanase,EGase)在植物的组织生长、开花、果实成熟、器官脱落等方面都具有非常重要的作用。本研究克隆了一个新的水稻β-1,4-葡聚糖内切酶家族基因Os GLU16。序列分析表明该基因位于水稻第8号染色体,c DNA全长1 827 bp,包含一个1 572 bp的开放阅读框,编码523个氨基酸残基。蛋白质同源性分析表明,Os GLU16基因编码的蛋白在第54~第516个氨基酸残基区域具有高度保守的GH9催化结构域。本研究成功构建了Os GLU16基因过表达载体p Ca MV35S-Os GLU16-EGFP,并获得了转基因水稻植株。植株表型分析表明,与野生型相比,过表达株系表现为株高和穗长显著下降。本研究初步探明了Os GLU16基因过表达转基因水稻植株的表型特征,这为进一步丰富β-1,4-葡聚糖内切酶基因家族在水稻生长发育过程中的作用提供理论基础。     

水稻OsCCCH基因家族的组织表达谱及胁迫诱导表达特征研究

CCCH型锌指蛋白是一类生物体中广泛存在的转录因子,在多种植物生物学过程中起着关键的调控作用。在水稻全基因组中已发现67个CCCH基因,分为8个亚家族,而其中大部分基因的功能尚缺少研究。本研究通过荧光定量RT-PCR技术分析了水稻Os CCCH家族基因的组织表达模式以及盐、PEG、低温等非生物胁迫和脱落酸(ABA)对CCCH基因的诱导表达特征。结果表明,大部分Os CCCH基因在各组织中有不同的表达模式,约30%基因为低丰度表达,50%以上基因表现为中丰度表达,极少Os CCCH基因为高丰度表达,包括Os C3H2、Os C3H35、Os C3H41、Os C3H43、Os C3H58和Os C3H67这6个组织优势表达基因。多数Os CCCH基因都不同程度地受到盐、PEG、低温及ABA的诱导或抑制,表明这些CCCH锌指蛋白可能参与水稻的非生物胁迫响应;在四种胁迫下,有7个基因同时受到诱导,其中Os C3H17基因上调倍数高达17倍以上;有10个基因同时被抑制,其中Os C3H16基因下调倍数高达31倍以上。     

水稻DUF966基因家族的生物信息学分析

DUF966基因家族是一类未知功能的基因家族,它们在水稻生长发育和逆境胁迫应答反应中可能起重要作用,为了研究这些基因的生物学功能,初步揭示它们对水稻生长发育和抗逆性的调控作用,本研究通过生物信息学方法,分析了水稻DUF966家族基因特征、系统进化、芯片表达谱、跨膜结构域、信号肽以及亚细胞定位。结果表明,水稻DUF966基因家族包含7个成员,几乎都具有转录活性,它们编码的蛋白质只包含1~2个保守的未知功能结构域(DUF966结构域);进化分析表明,该家族可分为4个亚群,其中Os DSR2、Os DSR4、Os DSR5和Os DSR6同属一个亚群,可能具有相似的生物学功能;芯片表达谱分析表明,该家族基因主要在幼苗、花序和茎中呈中、低度表达,Os DSR3和Os DSR7基因受盐和低温胁迫的诱导表达,其它基因受不同非生物胁迫的抑制表达,该家族多数基因还能被白叶枯病菌侵染诱导表达;蛋白预测表明,该家族蛋白不含跨膜结构域和信号肽序列,能够被定位在细胞质中。本研究为系统开展水稻DUF966基因家族的生物学功能研究提供了依据。     

水稻新生多肽结合复合体α链基因家族的表达分析

水稻新生多肽结合复合体α链(Osα-NAC)基因家族共有3个成员,分别位于第1,3,5号染色体。为研究Osα-NAC基因家族在逆境环境中的生物学功能,利用RT-q PCR和Western Blot技术,详细分析了Osα-NAC基因家族在不同组织中的表达情况,并进一步研究了Osα-NAC基因家族对非生物胁迫的应答模式。结果表明,在高盐和模拟干旱条件下,Os1g NAC和Os5g NAC基因表达上调,Os3g NAC基因表达下调,提示Osα-NAC基因家族各成员在水稻响应非生物胁迫的过程中发挥不同的作用。上述试验结果初步阐明该基因家族在非生物胁迫下的表达特性,为今后更深入研究该基因家族的功能提供了理论依据。     

水稻失控性细胞坏死突变体rcd1的鉴定与基因定位

本研究通过筛选水稻籼型恢复系明恢86的组培变异后代,获得一个失控性细胞坏死突变体rcd1(runaway cell death 1)。结果显示:从苗期后期起,rcd1叶片出现橙黄色类病斑;分蘖期后,类病斑性状加剧;抽穗期后,类病斑串联成片,茎、叶、穗干枯,并衰亡。q RT-PCR分析表明,Os PR1b、Os NAC4、Os PAL1、Os CHT1、Os CHT3、Os POC1等病程相关基因在rcd1类病斑叶片组织中表达量明显高于其在野生型叶片组织中的表达水平。田间调查发现,rcd1突变体表现出对胡麻斑病抗性增强。遗传分析显示,rcd1突变性状由单一隐性核基因控制。利用93-11与rcd1配制的F2群体进行基因定位,将rcd1定位在水稻第12染色体着丝粒附近In Del标记ID7909和ID8337之间约428 kb的区间。测序及共分离分析发现,rcd1与SL基因等位。在rcd1突变体中,SL基因编码区发生G1205T的单碱基突变,导致第370位氨基酸Arg→Leu的变异。本研究结果可为更深入解析rcd1调控水稻类病斑形成及抗病应答机制奠定了基础。     

‘大白谷’CC-NBS-LRR蛋白编码基因抗干尖线虫侵染时空表达研究

为深入探究‘大白谷’(Oryza sativa L.ssp.Indica)感病的分子机理,以及抗病基因在发病过程中所起的作用,克隆了‘大白谷’CC-NBS-LRR蛋白编码基因Os11g RGA8,对Os11g RGA8基因进行了生物信息学分析,并对其在水稻抗干尖线虫侵染过程中的功能进行了研究。Os11g RGA8基因位于11号染色体,其编码蛋白含有733个氨基酸,等电点为5.99,相对分子质量为84355.07。序列分析表明该氨基酸序列含有RX-CC、AAA_22、NBS和LRR_4这4个结构域,Os11g RGA8基因编码抗病蛋白属于CC-NBSLRR抗病蛋白家族。Q-PCR结果显示,接种水稻干尖线虫SAMN02420038的籼型常规稻‘大白谷’,与CK组‘大白谷’相比,Os11g RGA8基因表达量表现为上调,且24 h内上调增幅较缓,48 h时上调增幅突然上涨,72 h时上调增幅又出现下降,表明该基因参与‘大白谷’天然免疫反应过程,在水稻干尖线虫侵染过程中起到一定抗性作用。     

60Co辐射诱导水稻短穗小粒突变体sp18的表型鉴定与基因定位

利用⁶⁰Co辐射诱变贵州地方粳稻品种桥港珍珠米获得短穗小粒突变体sp18,鉴定其表型特征,并进行遗传与分子标记连锁分析,全基因组重组序列分析及突变基因分析。结果表明,与野生型相比,突变体sp18的株高增加,有效穗没有显著变化,而结实率、穗长、穗粒数和千粒重较野生型显著减少。利用水稻SSR标记进行初步定位,发现第11号染色体上的分子标记RM 167和RM 27150与目的基因连锁,物理距离分别为19.1 cM和41.5 cM处。突变体和野生型进行全基因组重测序分析,发现sp18在第11号染色体上缺失322 720 bp(7 189 868～7 512 630 bp之间)。在缺失区域内包括Os11g0235200、Os11g0235700、Os11g0235750、Os11g0236000、Os11g0236100、Os11g0236200、Os11g0237900、Os11g0238000、Os11g0238400、Os11g0238700、Os11g0239000、Os11g0239200、Os11g0239400、Os11g0239500、Os11g024060...     

水稻OsUAP2基因生物信息学分析及原核表达活性鉴定

UAGPase广泛存在于生物体,是糖代谢过程中一类重要酶。我们前期发现水稻Os UAP1具有单向催化UDPG分解代谢活性,Os UAP2与Os UAP1序列相似性极高。本研究对Os UAP2进行生物信息学分析,构建并表达重组蛋白,并鉴定其酶蛋白活性。结果表明,OsUAP2基因位于4号染色体,编码区序列长1482 bp,编码493个氨基酸;Os UAP2具有UDPGP保守结构域,无跨膜区域,N-端不含信号肽;二级结构分析显示,该蛋白含α-螺旋和无规则卷曲较多;同源性分析表明,Os UAP2与玉米UAGPase的亲缘关系最近。在16℃下经0.1 mmol/L IPTG诱导8 h,原核菌株BL21表达出分子量约55 kD可溶性重组蛋白。体外酶活性测定表明,Os UAP2能同时催化UDPG降解和合成,表现出双向可逆催化的特点。本研究结果为进一步深入研究OsUAP2基因的生物学功能提供了科学依据。     

水稻OsNCED4基因的克隆及功能初探

脱落酸(abscisic acid,ABA)是一种抑制植物生长的植物激素,因能促使叶子脱落而得名,在植物逆胁迫中发挥关键作用。由NCED基因编码的9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED),是ABA在高等植物中的关键酶。本研究已成功从水稻Ilmibyeo(O.sativa L.ssp.japonica)基因组中克隆得到Os NCED4,生物信息学分析表明,Os NCED4基因位于水稻第7号染色体上,ORF全长1749 bp,无内含子结构,编码582个氨基酸,具有NCED家族的RPE65保守结构;以该基因和其启动子序列构建组织表达载体pOsNCED4::GUS、pCaMV35S::OsNCED4:EGFP和RNAi干扰载体p Ca MV35S::OsNCED4:RNAi,用于基因表达和功能分析,并利用农杆菌介导的方法,成功获得了相应遗传载体的转基因植株;GUS染色结果表明,该基因在叶片、叶耳、小穗等组织部位均有表达;RT-PCR结果显示,Os NCED4在水稻不同生育期的根、茎、叶、叶鞘和穗子中均有不同程度的表达,但表达量具有明显的差异;亚细胞定位结果显示,OsNCED4基因编码的蛋白定位于细胞核;与野生型植株相比,RNAi植株的花粉育性无明显差异,而结实率显著下降。该研究结果为进一步研究水稻OsNCED4基因表达的调控,以及为水稻生长发育上的功能研究提供了科学依据。     

速递

<正>水稻SPL5基因在抗病应答中可起负调控作用Rice杂志最新研究表明,水稻SPL5(spotted leaf 5)突变体能自发产生类似超敏反应(hypersensitive response,HR)的细胞坏死斑(lesion),并显著增强对病原菌的抗性,说明SPL5基因在细胞死亡和抗病应答中起负调控的作用,但是SPL5介导的调控途径及其分子机制尚不清楚。该实验结果给SPL5基因调控机制提出了一个可能的模型:SPL5基因负调控转录因子Os WRKY14的表达,通过Os WRKY14介导水稻     

水稻类甜蛋白基因家族鉴定及表达的初步分析

本研究鉴定水稻基因组中类甜蛋白(TLP)家族基因,并对部分基因的组织表达特异性进行研究,为开展水稻类甜蛋白基因功能及分子进化机制研究提供基础。基于水稻基因组数据库,通过生物信息学方法对候选的47个水稻类甜蛋白基因家族成员进行鉴定、聚类及结构功能分析,通过q RT-PCR技术,检测14个Os TLP基因在LTH及其近等系水稻幼苗的叶片、根、叶鞘和花穗中的时空表达水平。基因和蛋白结构分析表明,Os TLP基因有5种结构类型,蛋白保守氨基酸基序高度一致。聚类分析显示,水稻类甜蛋白基因归属10个进化组,分布于12条染色体上,其中成员最多的进化组Ⅴ中的基因主要来自3号和12号染色体。q RT-PCR结果显示,14个Os TLP在6个品种水稻根、叶鞘、叶片和花穗中相对表达水平不同,多个基因在根中有较高的基础表达。本研究为进一步研究TLP家族在水稻生长发育和对抗胁迫中的作用提供了理论基础。     

蓖麻CNGC基因家族鉴定与冷胁迫下的表达模式分析

环核苷酸门控通道蛋白(cyclic nucleotide-gated channel proteins,CNGCs)是介导低价阳离子转运的重要蛋白,在植物信号传递、生长发育与非生物胁迫响应等方面发挥重要作用.本研究利用序列比对法在蓖麻基因组水平进行CNGC家族成员鉴定;利用生物信息学手段对蓖麻CNGC家族成员的基因结构、保守基序、特征结构域、聚类方式、顺式作用元件及染色体定位信息进行分析.研究成功鉴定到17个蓖麻CNGC基因家族成员,定位于16个未完整拼接的染色体片段上;除RcCNGC13外,其他蛋白序列均包含高度保守的环核苷酸结合结构域CNBD,但RcCNGC4\RcCNGC6\RcCNGC13\RcCNGC14均存在明显的基序缺失;部分RcCNGCs启动子区均含有MYB、MYC与ABRE、ARE元件,推测其响应逆境胁迫.聚类分析将蓖麻CNGC成员分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,推测不同类型CNGC蛋白存在功能差异.转录组数据分析发现仅有RcCNGC14受冷胁迫显著上调表达,暗示该基因参与调控蓖麻的冷适应性.本研究首次在蓖麻全基因组水平对CNGC基因家族进行鉴定,并分析其冷胁迫下的表达模式,为进一步创制蓖麻抗冷新种质提供重要的候选基因.