Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体实验室产品制备

试验应用自行分离鉴定的Ⅰ群4型禽腺病毒HY株,制备了3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体,并进行了性状、装量、无菌、支原体、外源病毒、安全、效力、甲醛和辛酸残留量检测。试验结果表明,试制的3批卵黄抗体呈淡黄色澄明液体;装量符合规定标准要求;无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染,安全性好,预防效果好。     

Ⅰ群禽腺病毒的诊断与防治

Ⅰ群禽腺病毒感染导致家禽心包积水综合征、包涵体肝炎等疾病,近几年主要流行毒株是FAdV-4、FAdV-8b及FAdV-11血清型。防控方案除了加强饲养管理,提高生物安全措施外,可制备腺病毒灭活疫苗进行预防,也可注射使用腺病毒抗体进行治疗。     

Ⅰ群禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及分子特性

【目的】对广东地区疑似心包积液–肝炎综合征患病鸡进行腺病毒分离鉴定并研究其分子特征。【方法】采集的病料样品,通过鸡胚有限稀释法经SPF鸡胚传代分离纯化病毒,进行致病性试验,并对病毒的hexon、fiber-2、ORF19和ORF29基因进行PCR扩增,分析其分子特征。【结果】hexon基因序列分析显示此次分离的毒株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型(命名为WM-XC株),SPF鸡接种分离毒株后,致死率达90%,死亡鸡只出现明显的心包积液、肝炎等变化,肝脏病理切片可观察到明显的嗜酸性包涵体,显示分离毒株具有致病性。fiber-2基因序列同经典毒株ON1和KR5相应序列的相似性达96.1%和97.0%,与2015年以来国内分离的毒株序列相似性则达到100%;ORF29序列与2013年国内分离到的毒株JSJ13和JN13的相应序列相比存在33个碱基的缺失;WM-XC分离株与2015年以来国内分离毒株序列相同,但相比经典株ON1和KR-5,缺失ORF19序列。【结论】此次从广东地区分离到的血清4型Ⅰ群腺病毒,和近年国内其他地区分离的流行毒株一样,其fiber-2、ORF19和ORF29基因序列与经典毒株差异明显。     

蛋鸡Ⅰ亚群禽腺病毒感染的诊治

腺病毒是一种在全世界广泛存在侵袭家禽和野禽的一种病原体,病原主要分为Ⅰ群禽腺病毒、Ⅱ群禽腺病毒及Ⅲ群禽腺病毒。腺病毒能在健康家禽体内复制,但显现出的症状较为轻微,且通常没有明显的临床症状,但当家禽发生并发感染或其他因素刺激时,腺病毒会作为一种条件病原引起患病。本文以家禽中的蛋鸡为例,论述腺病毒中的Ⅰ群禽腺病毒感染的诊治措施。     

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体效价与鸡攻毒保护相关性试验

取实验室试制的卵黄抗体,用磷酸盐缓冲液稀释成Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体琼扩效价分别为12、14和18,取不同效价卵黄抗体接种21和42日龄鸡,24 h后进行攻毒保护试验。结果表明,随着卵黄抗体效价的升高,抗体对鸡的攻毒保护率也随之升高,即抗体效价与攻毒保护率呈正相关。     

Ⅰ群禽腺病毒双价油乳剂灭活苗的研究

[目的]提高国内Ⅰ群禽腺病毒疫苗的防控能力,防止Ⅰ群禽腺病毒蔓延.[方法]优化Ⅰ群禽腺病毒的增殖条件,以Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAV-4)及血清8型(FAV-8)的抗原液制备油乳剂单价及双价灭活苗,比较甲醛及β-丙内酯(BPL)的灭活效果,并检验疫苗性状、监测免疫抗体水平及进行免疫攻毒试验和田间试验.[结果]疫苗灭活以1.00 mL/L终浓度的甲醛或0.500 mL/L终浓度的BPL为宜;3种疫苗均为白色状乳液,4 ℃下保存期均可达12个月,单价疫苗的最小免疫剂量为100 μL/羽,双价疫苗的最小免疫剂量为250 μL/羽;免疫抗体水平监测结果表明,免疫后第4周抗体水平达到峰值,且在免疫后第8周仍维持较高水平;免疫攻毒试验结果显示,3种疫苗的保护率均为100%,能完全抵抗病毒攻击;田间试验结果表明,在免疫初期3种疫苗抗体均达到预期免疫效果,免疫保护期在6个月以上,在生产中使用双价疫苗可以减少注射次数.[结论]FAV-4、FAV-8双价油乳剂灭活苗免疫效果好、保存期长、安全性好,为净化Ⅰ群禽腺病毒提供了技术支撑.     

Ⅰ群禽腺病毒双价油乳剂灭活苗的研究

【目的】提高国内I群禽腺病毒疫苗的防控能力,防止I群禽腺病毒蔓延。【方法】优化I群禽腺病毒的增殖条件,以I群禽腺病毒血清4型（FAV-4）及血清8型（FAV-8）的抗原液制备油乳剂单价及双价灭活苗,比较甲醛及β-丙内酯（BPL）的灭活效果,并检验疫苗性状、监测免疫抗体水平及进行免疫攻毒试验和田间试验。【结果】疫苗灭活以1.00 mL/L终浓度的甲醛或0.500 mL/L终浓度的BPL为宜;3种疫苗均为白色状乳液,4°C下保存期均可达12个月,单价疫苗的最小免疫剂量为100 μL/羽,双价疫苗的最小免疫剂量为250 μL/羽;免疫抗体水平监测结果表明,免疫后第4周抗体水平达到峰值,且在免疫后第8周仍维持较高水平;免疫攻毒试验结果显示,3种疫苗的保护率均为100%,能完全抵抗病毒攻击;田间试验结果表明,在免疫初期3种疫苗抗体均达到预期免疫效果,免疫保护期在6个月以上,在生产中使用双价疫苗可以减少注射次数。【结论】FAV-4、FAV-8双价油乳剂灭活苗免疫效果好、保存期长、安全性好,为净化I群禽腺病毒提供了技术支撑。     

Ⅰ群禽腺病毒血清4型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为储备禽腺病毒病疫情防控技术,应用DNAStar软件分析GenBank中Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)全基因序列,选取Hexon基因的保守区域设计合成1对PCR引物和1条TaqMan探针,建立FAdV-4 FQ-PCR检测方法,得到相应的标准曲线,并应用该方法对临床病例和人工感染动物进行FAdV-4核酸检测。结果表明,建立的FAdV-4 FQ-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。     

禽腺病毒4型感染的诊断与防制

2015年8月,河南新郑某鸡场30日龄肉鸡突然出现死亡。病死鸡心包内存在大量积液,肝脏充血、肿大。PCR检测禽腺病毒4型核酸,呈现阳性,结合发病情况和剖检病变,诊断为禽腺病毒4型感染。然后对该鸡场采取了综合防制措施,取得了较好的效果。     

禽腺病毒4型的分离与初步鉴定

从疑似心包积液综合征的病死鸡组织中分离获得1株病毒,该病毒无血凝活性,提取其核酸经禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽白血病病毒、传染性法氏囊病毒、禽偏肺病毒和包涵体肝炎病毒特异引物扩增均为阴性,而经禽腺病毒4型特异性引物检测为阳性,则将其暂命名为禽腺病毒4型FJ1674株。将其扩增产物回收后克隆,经序列测定分析表明该株病毒与国内外禽腺病毒4型毒株的同源率为99.4%~100%;经遗传进化分析表明,其与禽腺病毒4型关系密切,共处同一分支。     

4株禽腺病毒的鉴定和分析

[目的]对六安、郭河、宣城、肥西某养殖户送检的疑似腺病毒的病料进行分离鉴定,为进一步鉴别、预防和控制疾病提供科学的理论依据。[方法]首先采集病例中鸡的肝脏,提取病毒DNA,根据Genbank已登录腺病毒的hexon基因设计引物,通过PCR检测病料中腺病毒,对扩增的序列进行连接转化和阳性克隆子筛选,并对扩增到的序列进行测序鉴定,最后将获得的基因序列构建进化树分析确定安徽省部分地区禽腺病毒血清型。[结果]临床中疑似腺病毒感染的主要症状为心包积液和肝脏肿大,用设计的引物均检测出大小为599 bp的目的基因条带,序列比对结果发现,此次检测的腺病毒均为4型腺病毒。[结论]试验建立了快速检测禽腺病毒的方法,为安徽省地区禽腺病毒防控提供了理论依据。     

I群禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及分子特性

[目的]对广东地区疑似心包积液–肝炎综合征患病鸡进行腺病毒分离鉴定并研究其分子特征.[方法]采集的病料样品,通过鸡胚有限稀释法经SPF鸡胚传代分离纯化病毒,进行致病性试验,并对病毒的hexon、fiber-2、ORF19和ORF29基因进行PCR扩增,分析其分子特征.[结果]hexon基因序列分析显示此次分离的毒株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型(命名为WM-XC株),SPF鸡接种分离毒株后,致死率达90%,死亡鸡只出现明显的心包积液、肝炎等变化,肝脏病理切片可观察到明显的嗜酸性包涵体,显示分离毒株具有致病性.fiber-2基因序列同经典毒株ON1和KR5相应序列的相似性达96.1%和97.0%,与2015年以来国内分离的毒株序列相似性则达到100%;ORF29序列与2013年国内分离到的毒株JSJ13和JN13的相应序列相比存在33个碱基的缺失;WM-XC分离株与2015年以来国内分离毒株序列相同,但相比经典株ON1和KR-5,缺失ORF19序列.[结论]此次从广东地区分离到的血清4型Ⅰ群腺病毒,和近年国内其他地区分离的流行毒株一样,其fiber-2、ORF19和ORF29基因序列与经典毒株差异明显.     

污染疫苗的禽腺病毒分离和鉴定

在用非免疫鸡胚增殖鸭病毒性肝炎病毒(E52株)过程中，发现种毒受到污染。采用聚乙二醇沉淀．Sephadex G100柱层析法纯化污染病毒，在电镜下发现一大小为70～80nm，无囊膜，20面体对称的病毒颗粒。挑选4条随机引物对其进行反转录PCR扩增，共扩增出3条基因片段。序列分析结果表明，与禽腺病毒(鸡胚致死孤儿病毒)基因组部分序列同源性分别高达99．5％、99．6％和99．5％，从而证明禽腺病毒污染了鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒。     

Ⅰ群禽腺病毒五邻体基因的克隆及原核表达

根据GenBank中I群禽腺病毒(AAV)基因组序列,设计了1对特异性引物。以CELO毒株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出结构蛋白五邻体基因(penton),将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的EcoR I和Xho I位点,构建了原核表达载体pGEX-penton。将其转化到感受态细胞DH5α中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,获得了45.9 ku的融合蛋白。用不同的IPTG浓度和时间诱导表达,得出诱导的最佳IPTG浓度为1.5 mmol/L,最佳时间为4 h。用尿素提取包涵体表达产物,得到penton纯化蛋白,浓度为2.98 mg/mL。经Western-bolt分析,该蛋白具有良好的反应原性。     

西南部分地区Ⅰ群禽腺病毒的分子流行病学调查及致病性研究

2015—2016年,西南地区多个养鸡场发生疑似禽腺病毒感染病例。实验从发病鸡场采集肝组织,利用鸡胚肾细胞(CEK)进行病毒分离,共分离出16株Ⅰ群禽腺病毒(FAd V)。通过对hexon基因L1环临近的保守序列进行PCR扩增和序列测定,发现16株FAd V分属4个血清型,其中13株为FAd V-4型,FAd V-8a,FAd V-8b和FAd V-2型各占1株。选取不同血清型的4个代表毒株CH/SCDY/1604(FAd V-4)、CH/GZXF/1512(FAd V-2)、CH/CQBS/1504(FAd V-8a)、CH/CQBS/1512(FAd V-8b)进行鸡的致病性实验,结果显示,感染CH/SCDY/1604(FAd V-4)的死亡率达80%,CH/CQBS/1504(FAd V-8a)感染组死亡率为20%,而CH/GZXF/1512(FAd V-2)和CH/CQBS/1512(FAd V-8b)组的鸡只有发病没有死亡。FAd V-4是西南地区流行的主要血清型且其致病性极高,其致病性主要表现为心包积液综合征(HPS)。试验结果可为西南地区Ⅰ群禽腺病毒感染的防治提供参考。     

一株禽腺病毒4型病毒分离与鉴定

为了对某肉鸡场暴发的疾病进行确诊,对送检的病死鸡进行解剖、细菌分离和荧光PCR检测,并进一步进行鸡胚半数致死量(ELD₅₀)、动物回归试验和组织灭活疫苗研制。结果显示：病死鸡剖检可见肝脏肿大、出血,心包胶冻样积液,肾脏肿大,病料未分离到细菌。PCR检测禽腺病毒4型(FAV4)阳性,用处理液进行病毒分离,成功分离到一株FAV4病毒,扩增所分离病毒hexon基因部分序列,测序结果与GenBank上的FAV4 hexon基因(登录号：EF554403)相似性为100%。分离病毒盲传3代,测定的ELD₅₀为104.5/0.2 mL,以0.2 mL·只^-1的剂量胸部肌肉注射30日龄SPF鸡5只,4 d内鸡只全部死亡,病变与临床剖检病死鸡相似。取病死鸡肝脏制备组织灭活疫苗,免疫SPF鸡,能抵抗所分离FAV4病毒攻击。研究成功分离鉴定出一株FAV4病毒,并进行初步研究,丰富了毒种库,为FAV4病毒疫苗研制奠定了基础。     

禽腺病毒血清4型RPA-LFD 快速检测方法的建立

建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)检测方法。

将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关 Cas13a 蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a,CRISPR-Cas13a)技术相结合,针对FAdV-4 Hexon 基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA (crRNA),利用 RAA 技术扩增样本核酸,并进行 CRISPR-Cas13a荧光检测,以qPCR为对照方法,评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。

本研究所建立的方法反应过程均在 37 ℃恒温条件下完成,反应体系可检测的最低扩增拷贝数为10¹ copies/μL,灵敏度高,且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与 qPCR 检测的阳性检出率一致。

建立的RAA-Cas13a 方法检测 FAdV-4 具有简便、灵敏、特异等特点,可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。