本地毛形线虫49 ku排泄分泌蛋白基因的克隆及序列分析

为了获得本地毛形线虫(Trichinella nativa)49 ku ES蛋白的结构基因,用Trizol提取T.nativa肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa49 ku排泄分泌蛋白的结构基因。将PCR产物与T载体连接并经过大肠埃希菌增殖后送检测序。序列测定表明,目的基因TNPG长度为951bp,核苷酸序列同已发表的T.spiralis相应的序列P49同源性为98.63%,所推导的氨基酸序列同源性为99.05%。为T.nativa49 ku ES蛋白结构基因的进一步研究打下基础。     

黑龙江省猫旋毛虫18S rRNA基因分子克隆及序列分析

本文利用GenBank中发表的(Trichinella spiralis)18S rRNA序列为参考设计引物,对分离自黑龙江省猫体内的旋毛虫及本地毛形线虫(Trichinella nativa)的18S rRNA基因进行扩增,克隆后测序,序列分析结果表明:猫旋毛虫与旋毛形线虫基因同源性更高。     

旋毛虫各隔离种成虫在小鼠肠道中的分布

以旋毛虫国际标准种旋毛形线虫（Trichinella spiralis）和本地毛形线虫（Trichinella nativa）为对照，对黑龙江省猪、旋毛虫成虫在小鼠肠道中的分布进行了比较研究，研究结果表明：分别有76.3%，80.67%和86.18%，88.30%的猪旋毛虫、T.spiralis和旋毛虫、T.nativa分布于小肠的前、中段。说明猪旋毛虫、T.spiralis、犬旋毛虫、T.nativa的成虫均主要分布于小肠的前、中段，但犬旋毛虫、T.nativa、所占比例明显高于猪旋毛虫、T.spiralis，差异极显著（P＜0.01）。研究结果揭示，黑龙江省猪旋毛虫相当于旋毛形线虫（Trichinella spiralis），犬旋毛虫相当于本地毛形线虫（Trichinella.native）。     

旋毛虫各隔离种成虫肠期持续时间的研究

以旋毛虫国际标准种：旋毛形线虫（Trichinella spiralis）和本地毛形线虫（Trichiella nativa）为对照，对黑龙江省猪、犬旋毛虫成虫肠期持续时间了比较研究，研究结果表明：4个旋毛虫隔离种均在感染后的6－8d成虫回收率最高；猪旋毛虫和Txspiralis成虫肠期持续时间分别为22d和20d，犬旋毛虫和T.nativa分别为16d和14d。研究结果揭示，黑龙江省猪旋毛虫相当于旋毛形线虫（Trichinella spiralis），犬旋毛虫相当于本地毛形线虫（Trichinella nativa）。     

旋毛虫ITSⅡ区基因的克隆及其在分类学上的应用

克隆了6个不同旋毛虫隔离种的核糖体RNA ITSⅡ区的基因片段，序列分析结果表明，黑龙江省猪旋毛虫和猫旋毛虫为旋毛形线虫（Trichinella spiralis）；犬旋毛虫为本地毛形线虫（Trichinella nativa），与传统的分类结果基本一致，为传统的分类学方法提供了基础依据。     

旋毛虫各隔离种ITSⅡ区基因克隆和序列分析

克隆了6个不同旋毛虫隔离种的核糖体RNAITSⅡ区的基因片段，序列分析结果表明，黑龙江省猪旋毛虫和猫旋毛虫为旋毛形线虫（Trichinella spiralis）；犬旋毛虫为本地毛形线虫（Trichinella nativa）。结果与传统的分类结果基本一致，为传统的分类学方法提供了基础依据。     

猪旋毛虫McAb快速ELISA法的应用研究

本研究用保存在小鼠中的猪旋毛虫、旋毛形线虫（Trichinella spiralis)、犬旋毛虫、本地毛形线虫（Trichinella nativa)四种不同来源的旋毛虫隔离种接种断乳仔猪，定期用ELISA法检查抗体出现情况，剖杀后用鲜肉及冷冻不同时间的肉制成肉汁，进行ELISA抗体检测。结果表明：用ELISA法检出阳性的时间为：猪旋毛虫和T.spiralis在16天以后，犬旋毛虫和T.nativa在24天以后；鲜肉肉汁ELISA检测结果与其血清结果基本相同；冷肉肉汁检疫中，短期内冷冻对ELISA检测结果影响也不大。     

各隔离株旋毛虫感染性的研究

以旋毛虫国际标准种 :旋毛形线虫(Trichinella spiralis)和本地毛形线虫(Trichinella nativa )为对照 ,对黑龙江省猪、犬旋毛虫对大、小鼠和猪的感染性进行了比较研究。结果表明 :4个旋毛虫隔离株均对大鼠不易感 ,但相对犬旋毛虫和 T.nativa而言 ,猪旋毛虫和 T.spiralis对大鼠的感染性较高 (P <0 .0 1)。猪旋毛虫、 T.spiralis、犬旋毛虫、T.nativa在大鼠体内的繁殖力指数 (RCI)分别为 (35 .0 2± 8.37)、(32 .10± 7.77)和 (2 .90±1.71)、(2 .6 6± 2 .19)。 4个旋毛虫隔离株对小鼠和猪的感染性存在着明显差异 ,猪旋毛虫和T.spiralis对小鼠和猪的感染性较强 ,其在小鼠体内 RCI分别为 (137.4 1± 7.80 )和 (15 9.86±7.4 7) ,在猪体内的 RCI分别是 (385 .6 8±4 1.5 1)和 (30 0 .5 5± 12 .4 5 ) ;而犬旋毛虫和T.nativa对小鼠和猪的易感性差 ,其在小鼠体内 RCI分别是 (6 4.98± 5 .0 5 )和 (5 8.15±4 .6 9) ,在猪体内的 RCI分别为 (0 .0 6 4± 0 .0 31)和 (0 .0 33± 0 .0 33)。研究结果揭示 ,黑龙江省猪旋毛虫相当于旋毛形线虫 (Trichinellaspiralis) ,犬旋毛虫相当于本地毛形线虫(Trichinella nativa )     

旋毛虫各隔离种对低温耐受性的研究

用来自哈尔滨地区猪、犬体内的旋毛虫和国际标准虫株旋毛形线虫（Trichinella spiralis)、本地毛形线虫（Trichinella nativa)同时感染猪，在－22℃和－32℃条件下对感染了各旋毛虫的猪肉进行冷冻性试验，结果表明：哈尔滨地区猪旋毛虫和T.spiralis不耐低温，－32℃冷冻12h，－22℃冷冻48h全部死亡；而犬旋毛和T.nativa对低温抵抗力较强，－32℃、72h，－22℃、168h才全部死亡。     

黑龙江省猪、犬旋毛虫隔离种对兔的感染性研究

本文以旋毛虫国际标准种:旋毛形线虫(Trichinella spiralis)和本地毛形线虫(Trichinella nativa)为对照,从生物学方面对黑龙江省猪、犬旋毛虫病进行了分类研究,研究结果表明,4个旋毛虫隔离种对兔的感染性存在着明显差异,猪旋毛虫和T.spiralis对兔的感染性较强,其在兔体内的繁殖力指数(RCI)分别为62.29和143.05;而犬旋毛虫和T.nativa对兔易感性差,其在兔体内的RCI分别是10.65和12.19。     

旋毛虫肌幼虫分泌性蛋白P49基因的克隆与表达

通过设计、合成引物，以旋毛虫RNA为模板，用RT—PCR法扩增出旋毛虫P49序列，并进行了序列测定。将P49基因亚克隆至表达载体pET—28b中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，作SDS—PAGE及Western blot分析。结果表明，PCR法扩增出P49序列，其大小约为960bp，将构建的重组质粒pGEM—P49进行序列测定表明其与Genbank中的P49序列具有高度的同源性。成功构建了重组表达载体pET—P49；SDS—PAGR及Western blot分析表明，表达产物分子量约为38kDa，约占菌体总蛋白的7％左右，且能被感染旋毛虫猪阳性血清所识别。     

各旋毛虫隔种对猪的感染性试验

用消化法所得的猪旋毛虫、犬旋毛虫、旋毛形线虫 (Trichinellaspiralis)和本地毛形线虫 (Trichinellanativa)分别感染健康猪。结果表明 :4个旋毛虫隔离种对猪的感染性存在着明显差异 ,猪旋毛虫和T .spiralis对猪易感 ,其繁殖力指数 (RCI)分别为 385 .6 8± 41.5 1和 30 0 .5 5± 12 .45 ;而犬旋毛虫和T .nativa对猪不易感 ,RCI分别是 0 .0 6 4± 0 .0 31和 0 .0 33± 0 .0 33。结果揭示黑龙江省猪旋毛虫相当于T .spiralis,犬旋毛虫相当于T .nativa ;犬旋毛虫和T .nativa很难通过猪的感染而对人体健康构成威胁。     

旋毛虫各隔离种对小鼠的感染性研究

比较研究了黑龙江省猪、犬旋毛虫及国际标准虫种旋毛形线虫(Trichinella spiralis)和本地毛形线虫(Trichinella nativa)对小鼠的感染性异同。结果表明，四者对小鼠的感染力存在着显著差异，猪旋毛虫和旋毛形线虫在小鼠体内的繁殖力指数(RCI)分别为121.01±7.80和149.86±7.47；而犬旋毛虫和本地毛形线虫的RCI分别为60.98±5.05和55.15±4.69。由实验结果可认为黑龙江省的猪旋毛虫相当于旋毛形线虫，而犬旋毛虫相当于本地毛形线虫。     

用DNA限制性片段长度多态性鉴定旋毛虫各隔离种

以旋毛虫国际标准虫种：旋毛形线虫（Trichinella spirlais）和本地长形线虫(Trichinella nativa）作对照,应用DNA限制性片段长度多态性（PELP）技术对黑龙江省猪、犬旋毛虫进行虫种鉴定。结果显示：猪旋毛虫和旋毛形线虫酶切图谱相同;犬旋毛虫和本地毛形线虫酶谱一致。结果提示,黑龙江猪旋毛虫为旋毛形线虫,犬旋毛虫为本地毛形线虫。     

猪、犬旋毛虫DNA限制性片段长度多态性分析

以旋毛虫国际标准虫种Ｔ．ｓｐｉｄａｉｓ和Ｔ．ｎａｔｉｖａ作对照,应用ＤＮＡ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）技术对黑龙江省猪、大旋毛虫进行虫种鉴定。结果显示：猪旋虫和Ｔ．ｓｐｉｒｌａｉｓ酶切图谱相同;犬旋毛虫和Ｔ．ｎａｔｉｖａ酶谱一致,结果提示,黑龙江猪旋毛虫为Ｔｓｐｉｒａｌｉｓ,犬旋毛虫为Ｔ．ｎａｔｉｖａ。     

旋毛虫病McAb快速ELISA诊断盒的应用研究

应用ＭｃＡｂ 快速ＥＬＩＳＡ 诊断盒,对感染了４ 个旋毛虫隔离种的猪定期检测其血清中抗体出现情况。结果,猪旋毛虫和旋毛形线虫（Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ）在感染２４ ｄ 后、犬旋毛虫和本地毛形线虫（ Ｔ．ｎａｔｉｖａ）３１ ｄ 后,可在猪血清中检出抗体;在抗体出现时间上前二者较后二者早７ ｄ 左右。     

旋毛虫各隔离种雌虫生殖能力的实验研究

本试验对旋毛虫各隔离种雌虫体外产新生幼虫能力进行了研究。结果显示，猪旋毛虫和旋毛形线虫(Trichinella spiralis)雌虫体外培养24h平均产新生幼虫数分别为66.00±7.34和76.20±7.57，而犬旋毛虫和本地毛形线虫(Trichinella nativa)分别是28.80±4.30和22.00±3.22，前者在雌虫体外产幼虫能力上明显高于后者。研究结果表明，黑龙江猪旋毛虫相当于旋毛虫形线虫，犬旋毛虫相当于本地毛形线虫。     

Immunity in swine inoculated with larvae or extracts of a pig isolate and a sylvatic isolate of Trichinella spiralis

Inoculation of swine with a sylvatic isolate of Trichinella spiralis, designated T s nativa, resulted in low numbers of muscle larvae, compared with muscle larvae accumulation in swine inoculated with a pig type of T s spiralis. Despite low infectivity of T s nativa for swine, primary inoculation resulted in high levels of immunity against challenge infection with T s spiralis. This immunity was expressed in accelerated expulsion of challenge adults from the intestine and reduced numbers of muscle larvae. Pigs inoculated with T s nativa developed cellular and humoral responses similar to those in pigs inoculated with T s spiralis. However, in immunoblots, sera from pigs inoculated with T s nativa recognized additional proteins in muscle larvae excretory-secretory (ES) products, compared with sera from pigs inoculated with T s spiralis. Active immunization of pigs with ES products from T s nativa resulted in numerically higher, but not significantly different levels of immunity, compared with pigs immunized with ES from T s spiralis. The highest levels of immunity were obtained in pigs immunized with a T s spiralis newborn larval extract. The combination of ES products and newborn larval extract did not result in additive levels of immunity. These results indicate that the major immune effector response to Trichinella sp in pigs is against the newborn larvae, regardless of the genetic type of Trichinella sp.     

PCR检测感染早期小鼠血液中旋毛虫幼虫的研究

为了研究PCR检测感染小鼠血液中旋毛虫DNA的敏感性,应用旋毛虫1.6 kb重复序列为扩增靶序列对旋毛虫(T1)、乡土旋毛虫(T2)、布氏旋毛虫(T3)、伪旋毛虫(T4)和南方旋毛虫(T7)肌幼虫DNA进行PCR扩增,并检测小鼠感染20、100、300条T1肌幼虫后不同时间的外周血.结果表明,T1、T4和T7肌幼虫可扩增出特异性目的条带(510 bp),而T2和T3无扩增产物;1、0.04和0.02条T1、T4和T7肌幼虫均能扩增到清晰的目的条带(510 bp).20条幼虫感染小鼠后5 d～6 d,PCR阳性率均为7.69%;100条幼虫感染小鼠后5 d～12 d可检出旋毛虫DNA,其中感染后5 d～7 d的阳性率分别为30.77%、38.46%及30.77%;300条幼虫感染小鼠后5 d～15 d可检出旋毛虫DNA,感染后7 d的阳性率为61.54%,感染后6 d与8 d～10 d的阳性率均为53.85%. 3组旋毛虫感染小鼠PCR阳性率间的差异有统计学意义(p<0.01),PCR阳性率随感染剂量的增加而升高(p<0.01),100条与300条感染小鼠感染后不同时间的PCR阳性率与检测时间有相关性(p<0.01).以上实验结果表明PCR检测感染小鼠血液中旋毛虫DNA的敏感性与感染程度和检测时间有关,对感染早期旋毛虫抗体阴性宿主有一定诊断价值.