SRBSDV P8蛋白的多克隆抗体制备及其应用

克隆了南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的核心蛋白P8基因,并利用Gateway原核表达系统,将P8基因构建到原核表达载体pDEST17上,经转化大肠杆菌表达菌株Rosetta细胞,通过IPTG诱导P8蛋白表达。以原核表达的P8蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western blotting检测,结果显示抗体能够特异性地结合P8蛋白。Dot-ELISA分析表明,制备的P8抗体能够检测感染SRBSDV的水稻植株。间接ELISA分析表明,抗体滴度为1∶3 200。说明本实验所制备的抗体可用于田间南方水稻黑条矮缩病的检测,同时也为研究SRBSDV P8蛋白的功能及其与昆虫和寄主之间的互作奠定了基础。     

水稻黑条矮缩病毒基因组S7编码的2个非结构蛋白在病株中的表达检测

 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）基因组片段S7含有2个非重叠的阅读框,所编码的蛋白分别为p7a和p7b。根据RBSDV S7序列（EU111804）设计特异性引物分别扩增编码p7a和p7b蛋白的基因片段,并亚克隆至原核表达载体pET 32a（+）和pSBET上,再以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或BL21(DE3)pLysE为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的蛋白免疫小鼠,制备了p7a和p7b蛋白的特异性抗血清。蛋白质印迹分析表明p7a和p7b蛋白均在水稻病株中表达,但p7a含量较为丰富,易于在病株中检测到,而p7b在病株中含量则很低;在病毒粒子中,两者均未检测到任何信号,表明两者均为RBSDV的非结构蛋白。     

花生AhGPAT9与AhLPAAT4基因的原核表达及Western Blot分析

酰基转移酶基因家族是甘油三酯合成的关键基因。本研究以前期克隆的AhGPAT9与AhLPAAT4基因部分序列设计引物,构建原核表达载体,转化进大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE检测表明,重组蛋白在37℃,5h诱导条件下获得高效表达。重组蛋白经纯化和富集,对新西兰兔进行4次免疫,纯化获得的多克隆抗血清,通过间接ELISA检测,表明获得了效价比较高的多克隆抗体。通过对重组蛋白纯化后样品进行Western Blot分析,结果显示在纯化样品相应位置有明显信号,表明所制备的抗体具有很高灵敏度和特异性。并采用制备的抗体对AhGPAT9与AhLPAAT4蛋白在花生不同组织及种子不同发育时期的表达进行了Western Blot分析。为深入研究AhGPAT9与AhLPAAT4基因的功能提供了科学数据。     

玉米质体型淀粉磷酸化酶抗体的制备

通过同源基因基因克隆、原核表达载体构建、GST融合蛋白诱导表达与纯化、新西兰大白兔免疫、抗血清分离和纯化制备了SPI多克隆抗体,并进行了玉米体内蛋白Western blot验证。结果表明,成功构建的PGEX-6T-1-SPI-C表达载体在大肠杆菌中表达并纯化了GST-SPI-C融合蛋白,通过免疫新西兰大白兔制备并纯化了SPI多克隆抗体。制备的SPI多克隆抗体不但能识别GST-SPI-C融合蛋白,而且能识别玉米体内全长SPI蛋白(112 kD),并具有较好的特异性。玉米子粒和胚乳的Western blot检测表明,SPI蛋白主要积累在胚乳中,与mRNA定量结果一致。     

茶树α-tubulin基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

根据茶树α-微管蛋白(α-tubulin)的mRNA全长序列(GenBank登录号DQ340766)设计引物,以RT-PCR方法扩增茶树α-tubulin基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,并转化至大肠杆菌BL21trxB(DE3)中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式表达。以纯化后的α-tubulin融合蛋白制备兔多克隆抗体,用Westernblot方法检测抗体特异性。结果显示α-tubulin蛋白以包涵体形式大量表达,以融合蛋白制备的抗体对茶树体内的α-tubulin具有良好的特异性。     

水稻小热休克蛋白OsHSP20抗体特性鉴定及应用

【目的】在前期克隆了一个水稻小热休克蛋白(OsHSP20)的基础上,进一步分析该蛋白多克隆抗体的免疫反应特性和应用范围,为深入鉴定该类基因的功能奠定基础。【方法】利用合成多肽和其原核表达产物分别免疫家兔制备了相应的多克隆抗体;ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA用于分析比较多克隆抗体效价和灵敏度;Western blot用于鉴定多克隆抗体的特异性和应用范围。【结果】Western blot分析显示,利用重组OsHSP20蛋白及其合成多肽所制备的多克隆抗体均可以在原核表达OsSHSP样品中特异性检测到1条大小与预期一致(37kD)的条带,表明两种方法获得的多克隆抗体都具有高度的特异性;ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA分析表明,利用重组蛋白制备的多克隆抗体效价和灵敏度均高于利用多肽制备的抗体。进一步的Westernblot分析显示该抗体可用于多种植物小热休克蛋白(SHSP)的检测。【结论】制备了OsHSP20蛋白质抗体,且具有高度的特异性和较高的效价和灵敏度,可广泛地用于多种单、双子叶植物HSP20蛋白的表达分析,有助于OsHSP20及其他植物同源蛋白的功能鉴定。     

一个水稻小热休克蛋白的异源表达及寡聚特性分析

【目的】在前期研究中,本实验室已克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6),并发现该基因的表达明显受到热激和病毒侵染调控,表明该蛋白可能在逆境胁迫过程中起重要作用。本研究的目的在于进一步明确OsSHSP17.6的特性。【方法】在本研究中,进一步将该基因亚克隆至原核表达载体p ET-32a并导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS诱导表达,通过亲和层析的方法纯化了该重组蛋白,进一步用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析。【结果】异源表达的重组OsSHSP17.6能减轻IPTG对宿主菌的毒害。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting分析显示纯化的重组OsSHSP17.6蛋白在体外能形成同源二聚体和寡聚体。【结论】这些结果支持OsSHSP17.6是一个有功能的分子伴侣蛋白并表明该蛋白可能通过形成同源寡聚体的方式参与逆境胁迫反应,这为进一步明确OsSHSP17.6的功能机制奠定基础。     

水稻瘤矮病毒S9基因的生物信息学分析及原核表达蛋白的抗血清制备

以广东德庆市水稻瘤矮病的典型病株为材料,RT-PCR扩增并克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)的第9组分全长核苷酸序列。生物信息学分析表明,其基因结构特征与已报道的其他分离物基本一致。Pns9蛋白为细胞膜外蛋白,在植物呼肠孤病毒属内没有发现同源蛋白,与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的入口蛋白(portal protein)及姜氏军团菌(Legionella drancourtii LLAP12)的假设蛋白(hypothetical protein LDG_3259)分别有33%和24%的氨基酸序列相似性,功能尚待确定。将S9基因克隆至原核表达载体pET-28b(+)得到高效表达,融合蛋白经亲和层析纯化后,免疫新西兰大白兔制备抗血清。Western blot和ELISA分析表明制备的兔抗为特异抗血清,效价为1∶13 1072。     

黄早四泛素连接酶Rbx1的分子克隆及原核表达

通过RT-PCR方法和基因克隆技术对黄早四Rbx1基因进行分子克隆和序列分析,构建黄早四Rbx1的原核表达系统,成功表达出带有His标签的黄早四Rbx1融合蛋白,并进一步利用His抗体,用蛋白免疫印迹的方法对重组蛋白进行鉴定。结果表明,重组蛋白能够与His抗体发生免疫反应,验证了黄早四Rbx1在原核表达系统中成功表达。     

甘蔗黄叶病毒P0基因的克隆与原核表达及抗血清制备

根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物,应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的 DNA片段。以pET32a(+)为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-P0。经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在;P0融合蛋白大小约45kDa,与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符,用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清,通过酶联法(ID-ELISA)测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1∶25000。     

香蕉束顶病毒海口分离物Rb蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗血清制备

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。     

湘油15 PGIP9蛋白基因的克隆和蛋白序列结构分析及原核表达

运用生物信息学软件对湘油15 PGIP9基因的核苷酸、蛋白氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测.结果表明:湘油15 PGIP9编码区CDS长1011 bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,分子量为37.5kDa,等电点为7.9.N端1～22个氨基酸是信号肽,且这一区域疏水性较强,具有5个潜在的N-糖基化位点.N端和C端还各具有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基.二级结构显示有11个α-螺旋,14个β-延伸和25个无规则卷曲.中心LRR结构域由6个串联的LRR基序组成.随后将PGIP9的CDS序列亚克隆到原核表达载体pET -32a(+)中,构建pET - 32a - PGIP9重组表达质粒,并转化E.coil BL21(DE3),25℃,终浓度为0.2 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导2h,都成功的表达了融合蛋白pET - 32a - PGIP9,其分子量约为52kDa,发现主要以包涵体形式存在.没有可溶形式的蛋白表达.     

大肠杆菌glgC基因的定点突变及高效表达

通过PCR方法,从E.coliJM109基因组DNA中扩增到全长为1296bp的glgC基因,对其进行定点突变,获得第296位和336位氨基酸同时突变的glgC336基因。将2者亚克隆进pET-30a,成功构建了重组表达载体pET-C和pET-C336,转化大肠杆菌BL21(DE3),在1mmol/LIPTG诱导下进行表达。SDS-PAGE电泳分析显示,在约53kD处有1条明显的蛋白表达带,证明目的基因已得到高效表达,且重组蛋白表达量占菌体蛋白总量的77.3%。     

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其表达产物抗血清的制备

用pET－21d构建齿兰环斑病毒（ORSV）外壳蛋白基因大肠杆菌表达载体pEO。经SDS－PAGE和Westernblotting分析，含pEO的大肠杆菌正确表达了ORSV外壳蛋白基因。此表达产物为融合蛋白。用表达产物制备抗血清，并应用于间接酶联法检测ORSV，具有较高的灵敏度（10ng／mLORSV）和特异性。     

稻瘟病菌Rab5蛋白的表达及互作蛋白的初步筛选

Rab5是Rab蛋白家族成员之一,它主要负责调控胞吞作用中囊泡与早期内含体的融合。通过构建MoRab5的原核表达载体,成功诱导了pET-28a-MoRab5融合蛋白的表达,并获得了纯化蛋白,通过His Pulldown检测到一些可能与Rab5互作的蛋白。     

茶毛虫核型多角体病毒ph基因抗体的制备与利用

以茶毛虫核型多角体病毒(EupsNPV)的基因组DNA为模板,PCR扩增出全长为741bp的ph基因编码区片段。将Ep-ph编码区插入pET-28-a,构建了原核表达载体pET-28-a-Ep-ph,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了高效的表达。以经表达纯化的目的融合蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备了EupsNPV的ph抗体,测得的抗体效价为6.4×104。Western blotting检测表明制得的抗体对核型多角体病毒有良好的特异性。利用制备的抗体用间接ELISA方法对茶毛虫病毒样品进行了定量分析,得到线性回归方程为y=0.4152x-0.8299,相关系数r=0.9897(P<0.01)。间接ELISA方法表明该抗体可以用于核型多角体病毒生物农药的定量检测,从而为核型多角体病毒的检测农药制剂提供了一种准确有效的方法。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX具有抑菌、抗褐变和保鲜功能。以短短芽胞杆菌菌株FJAT-0809-GLX总DNA为模板,采用PCR扩增超氧化物歧化酶(Supseroxide dismutase,SOD)基因,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行序列测定,结果显示SOD基因序列长度为609 bp(Gen Bank登录号:KM255665),编码202个氨基酸残基。将SOD基因片段与同样酶切的表达载体p ET-28a连接,构建重组表达载体p ET-28a-SOD,转入大肠杆菌BL-21,采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在菌体中存在约25 ku的蛋白表达产物,与该基因ORF预期大小接近。以上结果为进一步研究该酶的生理生化特性奠定了基础。     

建兰花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

通过间接酶联免疫检测和电镜观察对从福建省漳州市采集的卡特兰病样进行检测,证明样品感染了建兰花叶病毒。设计一对特异性引物,扩增并克隆病毒分离物的外壳蛋白基因,随后将目的基因插入pET-29a（＋）中构建相应的原核表达载体。目的蛋白经诱导表达及纯化后免疫家兔并获得了特异性抗血清。Westernblot检测结果表明,抗血清与诱导表达的CyMV外壳蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫法检测结果表明,抗血清可检测病汁液的最低稀释度达1∶51200,最佳工作浓度为1∶1000,病汁液灵敏度为0.39mg/mL,而与TMV等11种同源或异源病毒均无明显的血清学交叉反应。