RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展

RGA克隆法是利用抗病基因产物的保守结构域人工设计简并引物,以植物gDNA或cDNA为模板进行PCR扩增而克隆植物抗病基因同源序列的方法。随着各种植物基因组测序计划的完成及计算机和生物信息学的发展,植物抗病基因的克隆取得了很大进展,目前人们已经从植物中克隆得到100多个抗病基因。研究表明,大多数抗病基因都存在NBS-LRR、STK、LZ、TIR等功能保守的结构域,其中大部分都为NBS-LRR类型,利用NBS-LRR保守结构域设计PCR引物已经从植物中扩增出大量的RGA。简要综述了已克隆NBS-LRR类抗病基因的结构特点和功能、RGA法克隆NBS-LRR类抗病基因同源序列及其在葫芦科作物上应用的研究进展,并探讨其未来的发展与应用。     

南瓜 NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

依据已克隆植物抗病基因的保守氨基酸结构域合成相应简并引物,通过PCR扩增从南瓜基因组DNA中分离了8条南瓜抗病基因同源序列,通过对其编码的氨基酸序列分析表明这些RGAs均含有P-loop及GLPL等植物抗病基因中的保守结构域.经BLAST分析表明,分离的南瓜RGAs与已报道的甜瓜等植物的RGAs有较高的同源性.南瓜RGA的分离将为进一步从南瓜中分离功能性抗病基因打下基础,也为研究南瓜种质资源的起源与进化提供借鉴.     

果树R基因同源序列克隆的初步研究

用2对根据已知植物抗病基因(R基因)编码的蛋白质的NBS保守区而设计的特异简并引物,对荔枝、龙眼、芦柑、柚子及银杏的基因组DNA进行体外扩增.其中一对引物(P1/P2)在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中获得的扩增产物均表现为一条大小约500bp的明亮谱带,而银杏扩增产物的亮带则在约750bp处,且弥散在400 ～ 1000bp之间.另一对引物在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中没有特异扩增带,而在银杏中获得了一条400 ～ 600bp的较亮的宽带.将荔枝、龙眼、芦柑和柚子的500bp特异扩增带以及银杏的400 ～ 600bp条带回收克隆,并分别筛选几类阳性克隆进行测序.共获得15个片段的序列.经比较发现,来自荔枝、龙眼、芦柑和柚子的12个片段均属于NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列的一致性为15.5% ～ 47.1%;而3个来自银杏的片段均不是RGA,其中1个与反转录酶有较高的同源性,另2个在GeneBank中没有找到同源序列.该结果显示,应用同源扩增技术克隆果树RGA是可行的,但银杏作为古老的裸子植物,其抗病基因的结构与现代物种可能有很大差异.     

西瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

以植物丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类（STK）抗病基因产物催化结构域l的保守氨基酸序列设计简并引物,以西瓜基因组DNA为模板进行PCR,扩增,得到大约500bp的目的条带。重组质粒经PCPo检测后进行测序,获得1个有效序列,可以编码完整的氨基酸序列。同源性分析表明其具有STK保守结构域,与已经克隆的Pto、LrlO和Lectin等基因在氨基酸水平上的同源性为40．O％～54．O％。     

黄瓜抗病基因类似序列( RGA) 的同源性分析和Southern鉴定

 使用ClustalW和DNAMAN 3.0分析了本实验室克隆的15个黄瓜抗病基因类似序列(RGA)之间以及与烟草的N 基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因之间的同源性, 并对这些RGA进行了PCR和Southern验证与分析。结果表明: 15个黄瓜RGA中, 核苷酸序列同源性最高的是CsRGA2、CsRGA4和CsRGA5, 其次是CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和CsRGA9, CsRGA1和CsRGA3也存在较高的同源性; 其余的RGA同源性较低。在氨基酸序列上也表现了相同的特征。与N、L6和RPS2等抗病基因的产物之间同源性最高46% , 最低22%。根据核苷酸序列设计了15对特异引物, 用PCR方法验证了所有黄瓜RGA的存在, 其中CsRGA3在黄瓜品种间表现出多态性。利用特异引物PCR方法合成了15个黄瓜RGA的地高辛探针, 与EcoRⅤ酶解的黄瓜‘215’、‘129’和‘L18’的基因组DNA进行Southern杂交, 证实了各个RGA在基因组上的存在, 同时发现, CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15都是多拷贝,CsRGA3是单拷贝, 其余为双拷贝。     

番木瓜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源序列的克隆与特征分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因产物催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增番木瓜叶片基因组DNA和cDNA。在NCBI中用BlastX比对发现,5个来自基因组DNA的克隆和4个来自叶片cDNA的克隆可能编码的氨基酸残基序列属于STK蛋白激酶类抗病基因同源序列片段和受体样蛋白激酶基因的同源片段,命名为gPK1-gPK5和cPK1-cPK4,在GenBank注册得到序列号分别为AY693385-AY693389,AY738762-AY738765。除克隆gPK5含有内含子之外,其它都发现了连续阅读框ORF。通过分析除Gpk5之外的8个克隆可能编码氨基酸序列中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白激酶的9个催化保守结构域Ⅰ-Ⅸ,并利用ClustalW软件对8个克隆和已报道的抗病蛋白水稻Xa21和西红柿Pto氨基酸残基序列进行分子系统进化树分析发现,8个克隆不仅是受体样蛋白激酶基因的同源片段而且是抗病候选基因片段。     

黄瓜NBS类抗病基因类似物的生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对黄瓜NBS类抗病基因类似物(RGA基因)进行生物信息学分析,以预测RGA基因编码产物的理化性质、结构与功能,为进一步研究黄瓜抗病调控机制提供一定的理论依据。结果表明:RGA基因编码产物为一个长度达84个氨基酸的蛋白,其理论分子量为10 964.32Da,理论等电点为PI 9.36,不存在跨膜区域,主要定位在细胞质中;进化比对表明,黄瓜的NBS类抗病基因在亲缘关系上与西瓜最近,其次是丝瓜;二级结构为α-β型,具有较为明显的3个螺旋和2个折叠;具有酰化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点3个功能位点;预测RGA基因编码产物主要充当辅酶角色参与生化反应的调控,介导基因表达调控,在抗逆相关的信号通路以及种子胚的发育等过程中发挥重要的生理功能。     

番茄抗病基因Tm-22及其等位基因氨基酸序列的比较

 从4个番茄栽培品种（Lycopersicon esculentum Miller）中获得了Tm-2²等位基因的同源克隆，进行序列分析，结果表明：'沙龙'、'渝抗2号'和'97-4'分别与'GCR-267'（Tm-2²）、'GCR-236'(tm-2)、以及'GCR-26'(tm-2)有100％的同源性, 而樱桃番茄（Lycopersicon peruvianum. var.cerasiforme）品种'樱红1号'与'GCR-26'（tm-2）仅有98％的同源性；在C-端的LRR结构域中，抗病基因 Tm-2²和Tm-2 编码蛋白的氨基酸序列与感病基因tm-2存在624和704两个位点的氨基酸差异，即624位点的脯氨酸（P）对应亮氨酸（L）、704位点的甲硫氨酸（M）对应异亮氨酸（I）； 在601-790个氨基酸的LRR结构域中，抗病基因Tm-2²、Tm-2及其秘鲁种（Lycopersicon peruvianum var. dentatum）lptm-2三者均与感病基因tm-2的编码蛋白存在23个氨基酸的差异；（4）樱桃番茄品种'樱红1号'与含有tm-2基因的栽培种之间具有同源性关系。     

百合品种抗病基因同源序列分析及抗枯萎病的鉴定

 采用鳞片接种法对36个百合品种及5个野生种进行枯萎病（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）接种鉴定,筛选抗性优异资源。结果表明：百合品种及野生种中蕴藏丰富的抗枯萎病种质资源。利用RGA-PCR方法对百合遗传多样性进行分析,10对RGA引物在41个品种及野生种中共扩增条带159条,其中多态带156条,占总带数的98.1%。以相似系数0.71聚类,41个百合品种及野生种划分为7类。抗性表型与RGA相似性聚类结果表明,利用品种的抗性表型聚类,趋于抗病性相近的聚为一类;利用RGA相似性聚类,趋于遗传背景相近的聚为一类。百合品种RGA的DNA指纹多态性与枯萎病抗性遗传表型多样性无明显的对应关系。对亲本材料进行抗性鉴定和抗病基因同源序列多态性分析,能更准确地反映亲本的遗传背景,为百合枯萎病抗性基因鉴定及品种培育提供一定的理论依据。     

金柑FcRGA1抗溃疡病机制初探

NBS-LRR类抗病蛋白是植物中最丰富的一类R蛋白成员,该家族含有典型的NB-ARC结构域与LRR结构域,主要参与植物抵御病原物入侵的防御过程。从金柑（Fortunella crassifolia）中克隆了1个含有NB-ARC结构域的R基因,命名为FcRGA1。该基因含有3 954 bp的完整开放阅读框,编码1 317个氨基酸。qRT-PCR分析表明,FcRGA1在金柑的根、茎、叶中均有表达,叶片中最高,根中最低。溃疡病菌侵染可促进FcRGA1表达上调,接种后12 h表达量为对照的12.3倍。通过VIGS技术沉默金柑叶片FcRGA1后,溃疡病菌侵染的叶片失绿更为严重,病斑面积更大,菌落数与相对电导率显著增加,同时叶绿素含量与过氧化氢含量显著低于对照,表明FcRGA1可能通过对活性氧的调控影响金柑对溃疡病的抗性。     

植物花青素基因的克隆及应用——文献综述

评述了近十年来有关植物花青素的基因克隆研究进展及其应用前景。植物花青素代谢途径及其主要酶类的作用之研究已较为成熟，一大批调控植物花色的结构基因与调节基因已被克隆。利用外源基因导入、反义基因及共抑制原理已培育出了新色系观赏植物品种。用基因工程的方法培育蓝色月季的工作正在进行。利用结构基因和调节基因为创造新花色、植物体彩化、植物生长发育及研究植物的花青素代谢等开辟了广阔前景     

辣椒N 基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交SSH分析

 以含N 基因的辣椒(Capsicum annuum L. ) 为试验材料, 接种南方根结线虫(Meloidogyne incognita) 12、24、36 h的根尖材料作为测验方( tester) , 相应的未接种根尖材料作为驱动方( driver) , 构建一个南方根结线虫诱导N 基因表达早期的正向抑制消减杂交cDNA文库, 并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选, 获得了237条表达序列标签( EST) 。在GenBank上进行BLASTn与BLASTx分析, 得到148条功能已知的EST序列, 获得已知的上调抗性相关EST 68个。分离出了具有NBS2LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因, 防御作用相关的类萌芽素(GLP) 、HSR203J 蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因,抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因, 以及G蛋白、142323蛋白等多种信号蛋白基因。通过GeneOntology分析, N 基因介导的早期表达抗病基因涉及病原物的识别、抗性信号传导、过敏性坏死、系统获得性抗性以及植物细胞保护机制等多个方面, 并有许多功能未知的基因有待于进一步的研究。     

ipt基因在植物基因工程中的应用

异戊烯基转移酶IPT是细胞分裂素生物合成过程中的限速酶,其编码基因ipt已被克隆并得到广泛应用。简要介绍了在植物遗传转化中控制ipt表达的启动子,综述了ipt在植物基因工程中的应用,并分析了目前ipt基因在植物基因工程应用中存在的一些问题。     

柑橘溃疡病抗性育种专家系统构建

柑橘溃疡病严重危害我国柑橘产业的发展。进行溃疡病抗性育种是解决这一问题的根本。本文提出建立柑橘溃疡病抗性育种专家系统的设想。本专家系统根据福建省农业科学院果树研究所的育种经验设计而成，包含传统育种和现代育种2个部分，在此基础上，细分为抗感亲本的选择及选配、杂种鉴定、杂种抗性评价、已知抗病基因（R基因）的搜集、抗病候选基因（RGA）的获得、溃疡病抗性基因的克隆等6个模块，基本实现对柑橘溃疡病抗性育种的管理。     

马铃薯广谱抗病Rpi-blb1 同源基因抗性被进化晚疫病菌株克服

 马铃薯晚疫病广谱抗性基因Rpi-blb1（克隆于Solanum bulbocastanum）及其两个同源抗病基因Rpi-sto1（克隆于Solanum stoloniferum）和Rpi-pta1（克隆于Solanum papita）的抗性可能已被高度进化的晚疫病菌株所克服。为证实此观点,将从荷兰田间和墨西哥野外S. bulbocastanum 和S. stoloniferum 病株上采集的晚疫病菌株重新接种于具有共同遗传背景（感病栽培品种Desiree）的Rpi-blb1 及其同源基因转化体和3个野生种植株上,测试Rpi-blb1 及其同源基因的抗性是否已被克服。结果表明,采自墨西哥野外S. stoloniferum的两个菌株Pic99189 和Pic99192 已经克服了Rpi-blb1 及其同源基因的抗性;在野生种植株的测试中,只有S. papita 的抗性明显地被菌株Pic99192 所克服。同时发现在转基因植株离体叶片接种试验中,高抗晚疫病菌的转化体需要在多个转化体间进行选择。从采自中国4 个不同地区晚疫病菌株接种sto1.Desiree 转化体的小规模测试中可推断,Rpi-blb1 及其同源抗性基因在中国仍具有潜在的应用价值。     

马铃薯广谱抗病Rpi-blb1同源基因抗性被进化晚疫病菌株克服

马铃薯晚疫病广谱抗性基因Rpi-blb1(克隆于Solanum bulbocastanum)及其两个同源抗病基因Rpi-sto1(克隆于Solanum stoloniferum)和Rpi-pta1(克隆于Solanum papita)的抗性可能已被高度进化的晚疫病菌株所克服。为证实此观点,将从荷兰田间和墨西哥野外S.bulbocastanum和S.stoloniferum病株上采集的晚疫病菌株重新接种于具有共同遗传背景(感病栽培品种Desiree)的Rpi-blb1及其同源基因转化体和3个野生种植株上,测试Rpi-blb1及其同源基因的抗性是否已被克服。结果表明,采自墨西哥野外S.stoloniferum的两个菌株Pic99189和Pic99192已经克服了Rpi-blb1及其同源基因的抗性;在野生种植株的测试中,只有S.papita的抗性明显地被菌株Pic99192所克服。同时发现在转基因植株离体叶片接种试验中,高抗晚疫病菌的转化体需要在多个转化体间进行选择。从采自中国4个不同地区晚疫病菌株接种sto1.Desiree转化体的小规模测试中可推断,Rpi-blb1及其同源抗性基因在中国仍具有潜在的应用价值。     

草莓NBS—LRR家族基因FaNBS1的克隆与表达分析

利用同源克隆结合RACE技术从久香草莓茎尖cDNA中分离到一个抗病相关TIR-NBS-LRR类基因FaNBS1（GenBank登录号：HQ845018），解析了该基因及其编码蛋白的组织结构和同源特征；并采用半定量RT-PCR技术分析了该基因在不同组织中的表达差异和外源植物生长物质处理下的表达变化。该基因在基因组上长为2...     

霜霉病菌侵染的黄瓜叶片cDNA文库的构建及抗病相关基因筛选

以接种黄瓜霜霉病菌的抗病黄瓜品种‘649’的叶片为材料,使用改良SDS法提取总RNA,构建黄瓜叶片全长cDNA文库,得到的原始文库滴度为5.5 × 106 pfu • mL-1,扩增后的文库滴度达6.5 × 109 pfu • mL-1,重组率约为99%,插入片段在0.5 ~ 2.0 kb之间,大多在1.0 kb左右。随机选取3 360个克隆进行测序,共拼接出2 507个unigenes,其中包括211个重叠群（Contigs）和2 296个单拷贝EST（Singlets）。生物信息学分析显示：这些unigenes中存在427条与植物防御/抗病相关的基因,其中包括两类抗病基因和细胞程序性死亡相关基因,这些基因的发现为下一步研究黄瓜抗病机理,克隆抗霜霉病相关基因提供了重要的参考。     

香石竹ACC氧化酶基因的克隆及其正义反义表达载体的构建

利用在Genebank上已报道的香石竹ACC氧化酶(ACO)基因的CDNA序列设计特异引物,以香石竹品种'MASTER'的eDNA为模板进行PCR扩增,克隆香石竹ACC氧化酶(AC0)基因.测序结果显示,克隆基因的序列与报道序列完全一致.将克隆的ACC氧化酶(AC0)基因分别连接到植物表达载体PBI121启动子CaMV 35S的上游及下游,构建香石竹ACC氧化酶(Aco)基因的正义表达栽体PBI121-ACO及反义表达载体PBI121-anti ACO.经PCR鉴定,基因已成功构建到表达裁体上.为香石竹抗衰老基因工程育种奠定了基础.     

病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究进展

病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）是一种RNA 介导的植物抗病毒机制,近年来已被用作研究植物基因功能的反向遗传学手段。与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比,VIGS 技术研究周期短,不需要遗传转化,具有低成本、高通量等优势。因此,VIGS已被广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因的功能鉴定。综述了VIGS 的机制、技术发展、沉默效率的影响因素及其在植物基因功能鉴定中的应用,并对VIGS 在植物性状改良及植物保护方面的应用前景进行了展望。