共查询到20条相似文献,搜索用时 0 毫秒
1.
2.
3.
旨在建立一种高效、快速、准确的检测产气荚膜梭菌并分型的多重PCR方法。根据GenBank上公布的产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素的基因序列,设计、合成4对针对4种毒素的特异性引物。并通过改变引物浓度、退火温度等反应条件,对多重PCR方法进行优化。结果显示,对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素基因均扩增出了预期大小的目的条带,而金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、停乳链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌均未出现条带;当核酸质量浓度降至12.5μg/L时,仍可清晰地扩增出α、β、ε、ι毒素基因对应条带。在核酸质量浓度降至3.12μg/L时,仍可观察到α与ε毒素基因扩增出的条带。在核酸质量浓度降至0.78μg/L时,α毒素基因对应的条带仍可隐约可见。应用该方法对68份疑似产气荚膜梭菌导致猝死的牛鼻拭子样进行检测,其中有52份样品检测结果显示为C型产气荚膜梭菌,剩余16份样品均为非产气荚膜梭菌,阳性率为76%。结果表明,本研究建立的多重PCR方法特异性强、灵敏度高重复性好,可准确地鉴别区分5种类型的产气荚膜梭菌。在采样时仅需采取疑似病畜的鼻拭子,操作简便、快捷、安全。对临床检测病畜的产气荚膜梭菌病有较为重要的... 相似文献
4.
5.
D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究 总被引:3,自引:3,他引:0
利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906 bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54 ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2017,(8):1523-1527
根据GenBank中已发布的产气荚膜梭菌α,β,ε,ι毒素基因序列,设计并合成4对特异性引物,经过优化多重PCR反应条件,建立了检测产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR方法。特异性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型产气荚膜梭菌标准菌株均扩增出了相应的目的条带,而对诺维氏梭菌和腐败梭菌扩增为阴性;灵敏性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型标准菌株基因组DNA最低检测量分别为9.0,17.8,12.2,13.8,18.5pg;重复性试验表明,该方法有很好的重复性。应用所建立的方法从21份羊临床病料中检测出9株A型和1株C型产气荚膜梭菌。本试验建立的多重PCR方法可以进行产气荚膜梭菌的快速检测及5种毒素型的鉴别。 相似文献
7.
D型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与高效表达 总被引:1,自引:1,他引:0
为建立产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α毒素(cpa)克隆表达方法,应用PCR方法从羊源D型产气荚膜梭菌中扩增cpa成熟肽基因序列,将其插入pET-28b载体中,构建重组表达载体pET-28b-cpa;通过PCR扩增、双酶切和测序方法对重组载体进行鉴定及序列分析,然后转入BL21(DE3)pLysS中诱导表达;用SDS-PAGE检测目的蛋白大小及分布,Western blotting方法检测其反应原性。结果表明,所扩增的cpa基因大小为1110 bp,与GenBank参考序列同源性为99%以上;SDS-PAGE分析结果表明,目的蛋白大小为41.2 ku,与预期大小一致,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但主要以包涵体为主,两者分布均具有和天然毒素相似的反应原性。 相似文献
8.
9.
为利用TaqMan荧光定量PCR技术建立一种快速、敏感、特异的产气荚膜梭菌α毒素检测方法,根据产气荚膜梭菌各型之间共同的生物学特性,以编码产气荚膜梭菌α毒素的基因序列作为靶序列,设计1对引物和探针,分别以A、B、C、D 4个型的产气荚膜梭菌DNA为模板,通过优化引物、探针浓度和扩增条件,建立了TaqMan荧光定量PCR方法,同时对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了验证。结果显示:当上下游引物浓度和探针浓度均为0.25μmol/L时,Ct值最低;该方法与大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等细菌均无交叉反应,具有良好的特异性;灵敏度高,对A型产气荚膜梭菌基因组DNA的最低检测限为9.1 pg/μL;重复性好,组内及组间试验标准差均小于0.4;对2023年收集的24份样品进行检测,发现本方法的阳性检出率(20.83%)与商品试剂盒一致。综上,本研究建立了一种快速、灵敏、稳定、特异的TaqMan荧光定量PCR方法,可对产气荚膜梭菌α毒素进行快速检测,为防控产气荚膜梭菌病提供了有力的技术支撑。 相似文献
10.
产气荚膜梭菌型特异性多重PCR的研究 总被引:6,自引:0,他引:6
建立了一种简单且具有型特异性的产气荚膜梭菌的多重PCR诊断方法.结果表明,该PCR特异性好,只有产气荚膜梭菌呈现阳性,被检验的其他7种梭菌以及大肠杆菌、葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌均为阴性.该PCR具有较高的敏感性,最小检测量为4.2×105 CFU/mL,单个菌落稀释10倍后也能被检测出,适用于医院、防疫和兽医诊断等部门,具有重要的公共卫生意义. 相似文献
11.
12.
产气荚膜梭菌α毒素的研究进展 总被引:1,自引:1,他引:0
作者对产气荚膜梭菌α毒素的组成、理化性质、生物学特性、检测、结构功能、作用机理、分子遗传及其与氨基酸的组成和细胞膜之间的关系等方面的研究进展作了简要综述。 相似文献
13.
14.
抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
将 2种抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 ( Sc Fv)基因 Sc Fv-2 E3和 Sc Fv-1 A8克隆至表达载体p UC1 1 9、p HOG2 1和 p ET2 0 b中 ,构建了重组质粒 p UC2 E3和 p UC1 A8、p HOG2 E3和 p HOG1 A8、p ET2 E3和 p ET1 A8后 ,分别转化至受体菌 JM1 0 5、JM1 0 9和 BL2 1 ( DE3 )中 ,得到重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)、JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)及 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 )( p ET1 A8)。 ELISA检测表明 ,经 IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)及 JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)的菌培养上清中 ,在重组菌株 BL 2 1 ( DE3 )( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的胞周质中检测到了 Sc Fv的存在。 SDS-PAGE和薄层扫描分析表明 ,重组菌株 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 0 .9%和 0 .7%,其大小约为 2 60 0 0 ,且表达的目的蛋白具有中和磷脂酶 C的活性。 相似文献
15.
产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)的致病作用一般由它所产生的胞外酶或毒素诱导。主要有α -毒素、β -毒素、θ -毒素及其他的一些胞外酶。本文针对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。 相似文献
16.
建立了多重PCR检测产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因的方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,只有产气荚膜梭菌呈现阳性,被检验的其他梭菌以及大肠杆菌、葡萄球菌均为阴性;将肉汤菌液样品10倍系列稀释后进行检测,检测灵敏度达到1.2×104CFU/mL。收集40份牛粪便样品,进行PCR检测,32份样品中成功扩增出589 bp的α毒素基因片段,阳性率为80%。结果显示,建立的多重PCR检测方法可取代血清中和试验,用于产气荚膜梭菌分型,同时表明A型产气荚膜梭菌在当地奶牛场中较为普遍。 相似文献
17.
18.
梳理和总结了产气荚膜梭菌的主要毒素种类、生物学活性、致病机制等,为后续的毒素分型、快速检测方法建立以及相关致病机制研究提供参考。 相似文献
19.
20.
产气荚膜梭菌主要致死性毒素的研究进展 总被引:3,自引:0,他引:3
产气荚膜梭菌作为危害各国家畜养殖业的主要致病菌之一,受到国内外研究者的普遍关注.产气荚膜梭菌的主要致病因子是菌体产生的外毒素.近年来,国内外对其致病机理进行了深入研究,建立起简便、快速的检测方法,并且在防治手段方面取得了巨大突破.对产气荚膜梭菌的主要致死性毒素类型、致病机理、检测技术及其防治措施等方面的研究进展进行了阐述. 相似文献