椰心叶甲的生物防治

椰心叶甲是近年来传入我国的危险性有害生物。1994年,我国内陆将椰心叶甲列为禁止入境的二类植物检疫危险性害虫。目前椰心叶甲在我国海南省、广东省、台湾省和香港地区危害严重并有蔓延趋势,严重危害了椰子、槟榔等棕榈科植物。针对椰心叶甲的危害特征,在实际防治应用中,化学防治,物理防治等方法不能起到很好的效果,生物防治是比较重要的防治方法。本文综述了对于椰心叶甲生物防治常用的几种防治方法：释放寄生蜂、病源微生物和生物农药等。椰心叶甲的生物学防治措施,关键是开发新的防治措施和提高现有方法的防治技术,达到持续有效控制。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry3A结构域编码区的融合

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)毒素蛋白由3个不连续的结构域（domains)组成，其中结构域I为膜跨越区，与膜孔道形成有关，结构域Ⅱ，Ⅲ与受体结合有关。利用基因重组技术以鳞翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry1Aa与专一性有关的结构域编码区与对鞘翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry3A编码基因融合，构建成融合表达载体，为进一步构建Bt工程菌和Bt转基因植物奠定基础。     

苏云金芽胞杆菌WB5中营养期杀虫蛋白3Aa基因(vip3Aa)的克隆、表达与纯化

营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein,Vip)是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为Vip1、Vip2和Vip3三种,以Vip3的研究最为深入。Vip3A对鳞翅目(Lepidoptera)害虫具有广谱杀虫活性,具有重要研究意义。本研究以Bt WB5菌株总DNA为模板,采用PCR方法扩增vip3Aa(Gen Bank登录号:AAM22456)全长,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行酶切验证和序列测定。将vip3Aa基因片段与经同样酶切的表达载体p Czn1连接,构建重组表达载体p Czn1-vip3Aa,转入大肠杆菌Arctic ExpressTM(DE3),异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在沉淀和上清中均有约88 k D VIP3Aa蛋白质表达产物;采用Ni亲和树脂对上清中的VIP3Aa融合表达蛋白进行了纯化,获得了纯化蛋白。本研究成功亚克隆了vip3Aa基因,并表达纯化了VIP3Aa蛋白,为后续研究VIP3Aa蛋白在昆虫中肠的作用受体提供了基础资料。     

苏云金杆菌Cry2Ab可溶蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

苏云金杆菌Cry2Ab蛋白是一类对鳞翅目昆虫有特异性毒性作用的毒素蛋白,已广泛应用于针对鳞翅目害虫的防治之中。依据苏云金杆菌cry2Ab基因序列设计一对全长引物,从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)WB9菌株总DNA中克隆出cry2Ab基因全序列,构建Cry2Ab-PK表达载体,将获得的Cry2Ab-PK阳性克隆进行原核诱导表达,获得约90kD的Cry2Ab-GST融合蛋白,经批量纯化并切除GST标签后获得可溶Cry2Ab蛋白,约65kD。利用纯化Cry2Ab可溶蛋白免疫新西兰雄性大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备Cry2Ab兔源多克隆抗血清,通过间接ELISA法测定Cry2Ab抗血清效价超过1:150000。Western blot测定结果表明,制备的Cry2Ab兔源抗血清能特异性识别Cry2Aa及Cry2Ab抗原蛋白,不能识别Cry1Ab及Cry3Aa抗原蛋白。研究结果对深入研究Cry2A毒素蛋白作用机理及毒素与受体间互作关系提供了技术支持。     

Cry1Ac蛋白降解菌株FJSB3的分离鉴定及降解特性

从转Cry1Ac基因水稻种植田土壤中,分离纯化得到1株能高效降解Cry1Ac蛋白的细菌FJSB3。通过表型特征、16S rDNA扩增和电镜观察,初步鉴定FJSB3为寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。FJSB3发酵液能降解粗Bt蛋白。通过单因素试验确定FJSB3降解水稻秸秆中Cry1Ac蛋白的最适条...     

β-琼脂糖酶ⅠDagA的原核表达和活性鉴定

采用PCR技术从假别单胞菌（Pseudoalteromonas atlantica）19262基因组DNA中获得β-琼脂糖酶Ⅰ基因（dagA）及去除信号肽的编码序列dagA(▽),分别与载体pET21a连接后转入大肠杆菌（Escherichia coli）ER2566中,共表达分子伴侣DsbC及FkpA,筛选出以包涵体为主要表达形式的高效表达体系：ER2566-pET21a-dagA(▽)-DsbC菌株。包涵体蛋白达到菌体总蛋白的60%左右。包涵体用8 mol/L尿素溶解、镍离子亲和层析纯化和梯度稀释复性。SDS-PAGE检测表明,复性后的DagA蛋白相对分子质量约为30.8 kD,且具有水解琼脂糖的生物活性。酶学特性分析表明,在pH 4.8~6.8范围内,DagA蛋白活性保持60%以上,最适pH 5.8;在温度37~60 ℃均有活性,最适温度为55 ℃。     

β-琼脂糖酶I DagA的原核表达和活性鉴定

采用PCR技术从假别单胞菌（Pseudoalteromonas atlantica）19262基因组DNA中获得β-琼脂糖酶I基因（dagA）及去除信号肽的编码序列dagA（↓△）,分别与载体pET21a连接后转入大肠杆菌（Escherichia coli）ER2566中,共表达分子伴侣Ds-bc及FkpA,筛选出以包涵体为主要表达形式的高效表达体系：ER2566-pET21a-dagA（↓△）-DsbC菌株。包涵体蛋白达到菌体总蛋白的60％左右。包涵体用8mol／L尿素溶解、镍离子亲和层析纯化和梯度稀释复性。SDS-PAGE检测表明,复性后的DagA蛋白相对分子质量约为30.8kD,且具有水解琼脂糖的生物活性。酶学特性分析表明,在pH4.8-6.8范围内,DagA蛋白活性保持60％以上,最适pH5.8;在温度37-60℃均有活性,最适温度为55℃。     

转基因高粱Cry1Ab蛋白含量的比较研究

通过农杆菌介导法将杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入高粱恢复系115中,共获得13个独立的转基因株系,26株转基因植株,转化率为5.1%;GUS活性、PCR、Southern和Western杂交分析表明,此基因已整合进高粱基因组并得到正确表达。利用ELISA试剂盒测定Cry1Ab蛋白含量,结果表明,不同转基因植株的Cry1Ab蛋白含量有明显差异,最高可达0.850 μg/g,占可溶性蛋白的0.016%,还有一些转基因植株中不能表达;同一转基因植株的不同组织中表达量有明显差异,其顺序为：叶>颖壳>籽粒>根>茎;不同部位的叶片也有差异,其顺序为：中部叶>基部叶>新叶。     

口服急性毒性试验中Cry1C蛋白对鼠肠道菌群的影响

利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析不同ICR(institute of cancer researcch)小鼠在口服急性毒性试验中摄入Cry1C蛋白前后其肠道菌群的变化,进而对该抗虫蛋白的食用安全性进行较为深入的研究.DGGE图谱经UPGAMA聚类分析显示:小鼠间菌群结构存在较明显的个体差异;实验期间,对照组小鼠灌胃前后其菌群基本保持稳定;实验组小鼠试验前后肠道菌群变化差异较对照组明显.随着灌胃的停止其变化差异在经历过高峰后会随着停喂时间的延长而减小,且菌相有逐渐恢复灌胃前结构的趋势.从肠道菌相的角度分析可知:该抗虫Cry1C蛋白对小鼠是基本安全的.     

苏云金芽孢杆菌cry1Aa10杀虫晶体蛋白基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达

本研究从对鳞翅目昆虫有强毒性的苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＢｔ）菌株ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ－１－０２中克隆到一个３．５ｋｂ的杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙＩ－０２。全序列分析表明,该基因由３５３１ｂｐ的核苷酸组成,可编码１１７６个氨基酸组成的蛋白质,根据同源性比较,该基因被确定为ｃｒｙ１Ａａ基因。它与国外报道的Ｂｔｃｒｙ１Ａａ基因具有相似的限制性内切酶图谱,核苷酸和氨基酸序列     

基因工程菌诱导表达苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的条件优化

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,Vip)是在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)营养生长至对数中期到稳定期期间产生的一类蛋白。为获得苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的高效表达条件,本研究利用正交试验综合考察了大肠杆菌(Escherichia coli)重组基因工程菌BL21-p Czn1-Vip诱导过程中诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对Vip3Aa蛋白表达量的影响。结果表明,该工程菌目的蛋白的最优诱导表达条件:诱导温度21℃、诱导时间8 h、诱导剂(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dthiogalactoside,IPTG))浓度为200μg/m L;直观分析表明,影响目的蛋白表达量的最主要因素为诱导温度,其次为诱导时间,诱导剂浓度影响最小;方差分析结果表明,诱导温度的P值0.01、诱导时间的P值0.05、诱导剂浓度的P值0.05,与直观分析结果相一致;利用优化后诱导表达条件进行培养,测得目的蛋白最高表达量可占总蛋白的27.6%,相当于常规诱导方法的2.3倍。本研究为大量制备高纯度Vip3Aa蛋白及其深入的理论研究和实践应用提供了基础资料。     

Adsorption and desorption of monomeric Bt (Bacillus thuringiensis) Cry1Aa toxin on montmorillonite and kaolinite

Genetically modified crops, which produce pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis, release the toxins into soils through root exudates and upon decomposition of crop residues. Although the phenomena of gene transfer and emergence of resistance have been well documented, the fate of these toxins in soil has not yet been clearly elucidated. The aim of this study was to elucidate the adsorption and the desorbability of the Cry1Aa Bt insecticidal protein in contact with two sodium-saturated clays: montmorillonite and kaolinite. Because the toxin is released into soil in small quantities, it was assumed that it will be in a monomeric state in solution until it oligomerized on cell membranes. The originality of this study was to focus on the monomeric form of the protein. Specific sample conditions were required to avoid polymerisation. A pH above 6.5 and an ionic strength of at least 150 mM (NaCl) were necessary to keep the protein in solution and in a monomeric state. The adsorption isotherms obtained were of the L-type (low affinity) for both clays and fitted the Langmuir equation. The adsorption maximum of the toxin, calculated by the Langmuir nonlinear regression, decreased with increasing pH from 6.5, which was close to the isoelectric point, to 9. At pH 6.5, the calculated adsorption was 1.7 g g⁻¹ on montmorillonite and 0.04 g g⁻¹ on kaolinite. Desorbability measurements showed that a small fraction of toxin could be desorbed by water (up to 14%) and more by alkaline pH buffers (36 ± 7%), indicating that it was not tightly bound. Numerous surfactants were evaluated and the toxin was found to be easily desorbed from both clays when using zwitterionic and nonionic surfactants such as CHAPS, Triton-X-100, and Tween 20. This finding has important implications for the optimization of detection methods for Bt toxin in soil.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的可溶性表达与反应原性的鉴定

设计特异性引物扩增得到完整的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3AB基因,定向克隆到表达载体pET-30a中,获得了重组质粒pET-3AB,并转化大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21(DE3).重组菌分别在37℃和28℃条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,观察到37℃培养条件下目的蛋白形成包涵体,在28℃条件下培养目的蛋白以可溶性的形式表达.Western blot分析表明,表达的目的蛋白能与FMDV感染牛血清发生特异性反应.以纯化的3AB蛋白作为抗原,采用间接ELISA模式检测了部分FMDV感染动物血清和健康动物血清,证明表达蛋白与FMDV感染血清有很好的反应而与健康动物血清无反应.     

四价抗病虫除草剂RNAi植物表达载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗是重要的能源作物和糖料作物,面临病虫害日益严重问题。由于甘蔗遗传背景非常复杂,且缺乏必要种质,难以通过杂交培育抗病虫、除草剂聚合品种。基因工程技术提供了新方法。本研究利用BLAST比对获得甘蔗花叶病毒ScMV-CP基因和黄叶病毒ScYLV-CP基因的保守序列作为干扰序列,通过设计内切酶位点、生物合成和连接,获得全长687 bp的两个保守序列融合片段（MYCP）。并将其正向和反向插入中间载体pHANNIBAL上,形成双价病毒干扰结构。再通过在pHANNIBAL上添加SmaⅠ内切酶位点,将双价病毒干扰结构表达框和Cry1AC基因表达框结合;利用NotⅠ酶切,回收双价病毒干扰结构和Cry1AC基因表达框片段,连接到添加Bar基因表达框的表达载体pART27-Z上,构建了抗病虫及除草剂四价植物表达载体（pART27-MYCP-Cry1AC）。采用基因枪法将构建好的四价植物表达载体转入甘蔗品种FN15的胚性愈伤组织中,通过PPT（草丁膦）筛选获得了抗性再生甘蔗植株,经过PCR、定量以及Bt蛋白试纸检测,获得同时整合四种目的基因并表达的四价转基因甘蔗植株,为培育多抗甘蔗新品种提供了材料。     

Effects of temperature, water content and pH on degradation of Cry1Ab protein released from Bt corn straw in soil

We investigated the effects of soil temperature (15 °C, 25 °C, 35 °C), water content (20%, 33%, 50%) and pH (4.5, 7.0, 9.0) on the degradation of Cry1Ab protein released from the straw of Bt corn varieties 34B24 and 1246 × 1482 both expressing Cry1Ab protein. Our results showed that Cry1Ab protein released from both 34B24 and 1246 × 1482 straw was degraded in a similar way in all treatments, which demonstrated a rapid decline in the early stage but a slow decline in the middle and late stages. In the late stage (180 days after the experiment commenced) 0.03%-1.51% and 0.02%-0.91% of initial Cry1Ab protein released from 34B24 and 1246 × 1482 straw was detected in soil. In addition, degradation dynamics of Cry1Ab protein under different environmental conditions was well described by the shift-log model. DT₅₀ of Cry1Ab protein released from 34B24 and 1246 × 1482 straw was 0.97-9.97 d and 0.75-10.89 d, respectively, and DT₉₀ was 4.66-162.45 d and 6.44-57.46 d, respectively. The results suggested that soil temperature had significant effects on the degradation of Cry1Ab protein, with a higher degradation rate at higher temperature, but soil water content and pH had no obvious effects on the degradation of Cry1Ab protein.