白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。     

旱生植物梭梭actin基因片段的克隆及表达模式分析

本研究根据其它植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以3周龄梭梭整株总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析结果表明：该片段长约598 bp,编码198个氨基酸;该序列与GenBank中现有的植物Actin比对发现,同源性均高达84%,同时,翻译得到的氨基酸序列与其它植物的氨基酸序列同源性高达99%。表达实验分析表明在不同胁迫条件下该基因在梭梭不同组织中表达量恒定,可作为内参基因。梭梭actin基因片段的克隆可为研究重要抗逆功能基因在梭梭中的表达和调控机制奠定基础。     

巴西固氮螺菌Yu62glnZ基因及其相邻基因的克隆和序列分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense)Yu62的基因组文库中获得glnZ基因的阳性克隆，对该阳性克隆进行亚克隆和序列分析，结果表明glnZ基因位于3.7kb的SaLI片段上，glnZ基因编码区长336bp，编码的产物是Pz蛋白，由112个氨基酸组成，分子量为1.12kD。用Blastax软件对Pz蛋白的氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源比较，结果表明Pz蛋白与其它几种固氮菌及大肠杆菌的GlnK蛋白的同源性（identities）达66％以上；与PⅡ蛋白的同源性达64％以上。glnZ基因上游是部分ubiH-like基因，与E.coli ubjH基因（编码辅酶Q，ubiquinone)N－端有31％的同源性（identity）和50％相似性（similarity)；glnZ基因下游是aat-like基因，与E.coli和Bacillus subtilis aat基因（编码天冬氨酸氨基转移酶，aspartate aminotransferase)有同源性和相似性都为26％和42％；aat-like基因下游是部分ftsK-like基因，与E.coli ftsK基因（编码肽聚糖，peptidoglycan)N-端有42％同源性和56％相似性，这几个基因在GenBank中的登录呈是AF279917。     

长穗偃麦草HKT1;4基因片段的克隆及序列分析

根据已报道的其他植物高亲和钾离子转运蛋白（HKT1;4）基因的保守序列设计一对简并性引物,以长穗偃麦草幼根总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出长穗偃麦草HKT1;4,基因命名为EeHKT1;4。结果表明：该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,所得序列与其他植物氨基酸序列同源性均在80%以上,特别是和一粒小麦TmHKT1;4氨基酸同源性高达92%。这为长穗偃麦草HKT1;4全长基因的克隆及其耐盐分子机制的研究奠定基础。     

白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

猕猴桃ACC合成酶基因家族四个成员的克隆

通过PCR方法从中华猕猴桃中分离出ACC合成酶基因家族的四个成员（AC－ACS1A、AC－ACS1B、AC－ACS2和AC－ACS3）的基因组DNA片段，AC－ACS1A、AC－ACS1B和AC－ACS2与其它植物该基因的氨基酸序列同源性最高可达76％以上，而AC－ACS3与其它植物ACC合成酶基因的氨基酸序列同源性均低于60％，与已知的其它猕猴桃ACC合成酶基因的同源性在51％－56％之间，且不存在MSSFGL保守区，因而属于一个未见报道的新成员。     

甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因ChAI的克隆及序列分析

应用同源序列克隆策略从铝盐胁迫处理的甜瓜属野生种(Cucumis hystrix Chakr.) 叶片中获得了612bp的片段,通过在EST数据库进行同源检索,发现一条甜瓜EST序列（GenBank登录号：AM724963.2）与之高度同源,据此设计引物并经RT-PCR扩增和序列拼接,最后获得了铝诱导基因cDNA序列全长,命名为ChAI (GenBank登录号：FJ968438 )。序列分析表明该基因全长967bp,其中开放读码框(ORF)长711bp编码236个氨基酸组成的多肽,5′ 和3′ 端非编码区长度各为15bp和241bp。DNAMAN同源性分析表明该基因与葡萄、棉花、羊乳（轮叶党参）、白骨壤（真红树植物）、拟南芥等植物的铝诱导蛋白的氨基酸序列具有78.6%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对ChAI 基因的转录水平进行分析,根据该基因在铝胁迫下大量表达推测ChAI 与耐铝盐胁迫响应相关,但具体耐铝胁迫机制还有待深入研究。     

桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列（GenBank登录号：HQ453972）和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列（GenBank登录号：HQ453974）,并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为：GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

盐角草Cu/Zn-SOD基因的克隆及耐盐性分析

盐角草(Salicornia europaea)是一种典型的耐盐植物,为了研究盐角草Cu/Zn-SOD基因在的盐胁迫耐受中的机制,本研究利用已知植物Cu/Zn-SOD基因的保守序列设计简并引物,采用RACE技术的方法从盐角草中扩增获得Cu/Zn-SOD基因。使用生物学软件分析其氨基酸序列,并进行同源性比对。构建原核表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli),使目的蛋白在重组菌中表达,并分析了不同盐浓度并含有抗生素的液体LB培养基中菌的生长情况,IPTG诱导表达,通过测定OD600值来分析Cu/Zn-SOD基因的耐盐功能。结果通过简并引物PCR扩增和RACE技术,克隆出盐角草Cu/Zn-SOD基因。盐角草Cu/Zn-SOD基因(GenBank登录号:JQ074238.2)全长为660bp,开放阅读框长为459bp,推测编码152个氨基酸,蛋白分子量约为15.1kD,其氨基酸序列与碱蓬(Suaedasalsa)的序列相似性为96%,与黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)的序列相似性为88%。生物学软件分析表明Cu/Zn-SOD蛋白可能存在于细胞质。构建原核表达载体pET-Cu/Zn-SOD和对照pETDuet-1,转化大肠杆菌BL21中。蛋白经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE蛋白电泳检测发现表达蛋白条带大小与预期一致,说明目的蛋白成功表达。耐盐性分析表明重组菌BL21(pET-Cu/Zn-SOD)在高盐度培养基中的生长明显优于对照菌BL21(pETDuet-1),说明盐角草Cu/Zn-SOD基因可能在盐胁迫逆境中起到耐受性作用。     

小金海棠S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MxSAMS）的克隆和表达分析

从本实验室建立的小金海棠缺铁差减文库中分离出一个cDNA片段,在GenBank中发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因具有90%的同源性。利用RACE技术成功地获得小金海棠（Malus xiaojinensis）SAMS基因(MxSAMS)的cDNA全长序列（GenBank登录号：EU639408）,该基因cDNA全长1 479 bp,最大开放阅读框1 176 bp,编码392个氨基酸,酶蛋白理论分子量为42.99 kD;与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在88.1%~92.6%之间。推测的MxSAMS蛋白质三级结构包含3个保守结构域和一个保守的ATP结合位点GAGDQG。Southern 杂交显示,MxSAMS基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。半定量RT-PCR结果表明,该基因在小金海棠的根和叶中均受缺铁胁迫诱导增强表达。     

放牧率对高寒混播草地主要植物种群生态位的影响

对垂穗披碱草/星星草混播草地不同放牧率下22种植物种群优势度和生态位分化规律的研究结果表明:不同放牧率下混播草地的建群种相同,而次优势种和伴生种发生了明显变化;不同放牧率下混播草地的建群种垂穗披碱草因其高度和发达的根系成为竞争的优胜者,抑制了星星草的生长,因而其生态位宽度最大,为0.956,星星草次之,为0.821;不同放牧率下混播草地的建群种垂穗披碱草、星星草和侵入种早熟禾与其他植物种之间(除了草、紫羊茅和乳白香青)及彼此之间的生态位重叠均较大,而同属的鹅绒萎陵菜、多裂萎陵菜和雪白萎陵菜之间以及生活型相近的小嵩草、矮嵩草和青海苔草之间的生态位重叠也较大。这说明具有相同形态特征或生活型的物种之间生态位重叠较大,且生态位宽度较大的物种与其他种群间也有较大的生态位重叠,但分布于放牧演替系列两个极端的种群间生态位重叠较小。     

几种菊科植物BADH基因同源片段的克隆与序列分析

利用PCR-Southern的方法对菊科26个种和2个菊花（Dendranthema × grandiflora ）栽培品种的甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因进行了检测,其中18个种和2个栽培品种呈现明显的阳性信号。对其中7个种和1个栽培品种的PCR产物进行了测序（GenBank登录号：EF683587- 683595）,其中旋覆花中获得两个长度差异较大的序列。序列分析表明：在被克隆的基因片段中,外显子的长度在各种间是一致的,且同源性在83%以上,推测的氨基酸序列的同源性在90%以上,其中旋覆花长片段中保守十肽的第二个氨基酸由苏氨酸变异为丙氨酸。各序列内含子的长度差异较大,泽兰（Eupatorium lindleyanum）、祁州漏芦（Stemmacantha uniflora）、旋覆花（Inula japonica）长片段的内含子之间,及与其它序列的内含子之间均无明显的同源性,而其它序列的内含子间则表现出较高的同源性,且由内含子所反映的基因间的系统关系与外显子反映的系统关系基本一致。     

扎龙自然保护区大型土壤动物的群落结构

在扎龙国家自然保护区,选择了羊草、星星草、寸草苔和芦苇4种群落,对大型土壤动物生态特征进行了研究。研究结果表明,在四种群落中,共获得大型土壤动物75类,4359只,隶属于3门、7纲、21目、50科。优势类群是蚁科、棘跳虫科。大型土壤动物的类群数:芦苇群落=星星草群落>羊草群落>寸草苔群落,个体数:芦苇群落>星星草群落>羊草群落>寸草苔群落,寸草苔群落的生境条件最差,大型土壤动物的水平分布具有不均匀性;大型土壤动物的垂直分布基本都随土层深度的增加而递减,表现出明显的表聚性。大型土壤动物的季节动态表现为,类群数:夏季>秋季>春季;个体数:夏季>秋季>春季,春季不论是类群数还是个体数都是最低的。大型土壤动物的多样性表现为,寸草苔群落=星星草群落>芦苇群落>羊草群落。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。     

番茄ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯释放的抑制

筛选番茄(Lycopersicon esculentum)幼苗cDNA文库获得与番茄抗性相关的克隆E11,设计引物,利用RT-PCR方法从受到病原侵染的番茄叶片中获得长1018bp的候选片段,同源性分析发现该片段与其它作物上发表的ACO基因序列高度同源,同源率83%～99%,推断该基因为番茄ACO基因家族的新成员。在此基础上,用BP克隆的方法构建该基因的RNA干涉(RNAi)载体pD311,对番茄进行遗传转化,获得卡那霉素抗性植株27棵,分子检测证实外源片段成功导入番茄基因组中。对获得的转基因植株的乙烯生成量测定结果表明,RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达,从而导致乙烯的生成大大降低。