p38MAPK通路激活内质网应激参与高糖诱导血管平滑肌细胞钙化

目的 探讨p38 MAPK通路是否通过激活内质网应激及凋亡参与高糖所致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscular cell,VSMCs)钙化.方法 大鼠VSMCs分为对照组、高糖组(35 μmol/L D-葡萄糖)、内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)组、p38 MAPK通路抑制剂SB203580组、β-磷酸甘油组、4-PBA+高糖组、SB203580+高糖组、β-磷酸甘油+高糖组,分别用比色法、o-cresolphthalein法和Western blot测定碱性磷酸酶(ALP)活性、钙含量和骨分化转录因子(Runx2和Osterix)表达.结果 D-葡萄糖处理3、7 d上调VSMCs ALP活性、钙含量和骨分化标志蛋白表达;SB203580下调ALP活性、钙含量和骨分化转录因子表达,而4-PBA抑制高糖引起VSMCs内质网应激及凋亡.结论 p38 MAPK通路通过激活内质网应激和凋亡可能是高糖诱导VSMCs钙化的重要机制.     

辛伐他汀通过激活p38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖的研究

为研究辛伐他汀通过激活p38MAPK信号通路对小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖的影响,将试验分为2个部分:①将辛伐他汀作用于MC3T3-E1细胞,设置不同的辛伐他汀浓度和作用时间,采用pNPP、CCK8方法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性并得到辛伐他汀对MC3T3-E1细胞增殖作用的最适浓度和最佳培养时间....     

基于p38 MAPK信号通路研究养阴润目丸治疗干眼兔的作用机制

目的 探讨基于p38 MAPK信号通路研究养阴润目丸治疗干眼兔的作用机制。方法 采用氢溴酸东莨菪碱皮下注射途径制备干眼兔模型,按随机数字表法分成模型组、p38抑制剂组、阳性药物（杞菊地黄丸）组和低、中、高剂量养阴润目丸组,同步设不造模的正常组,6只/组。各组按相应处理方式连续干预2周后,检测各组兔泪液分泌量、泪腺病理形态、泪腺组织凋亡细胞的表达及泪腺组织中p38 MAPK、Bax、Bcl-2蛋白和mRNA表达情况。结果 养阴润目丸组和阳性药物组能增加干眼兔模型泪液分泌量,抑制泪腺细胞的凋亡,下调p38 MAPK、Bax的蛋白和mRNA表达,上调Bcl-2的蛋白和mRNA表达水平,与模型组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 养阴润目丸能够通过纠正Bax/Bcl-2失衡,改善干眼泪腺细胞凋亡,进而减轻泪腺细胞损伤,恢复泪腺细胞的代谢功能,与调控p38 MAPK的关系极为密切,这可能是其治疗干眼的重要机制之一。     

咯利普兰通过MAPK/ERK信号通路抑制中性粒细胞的黏附

【目的】研究磷酸二酯酶4(PDE4)特异性抑制剂咯利普兰抑制中性粒细胞黏附的有关分子机制,明确其抗炎的主要信号通路,为PDE4选择性中药抑制剂的药理研究提供参考。【方法】猪中性粒细胞的提取采用密度梯度离心法,中性粒细胞与猪内皮细胞的黏附采用虎红比色法,中性粒细胞黏附分LFA-1和Mac-1表达量的检测采用流式细胞技术,中性粒细胞p38MAPK、ERK等磷酸化活性检测采用western blot法。【结果】咯利普兰可显著抑制fMLP刺激的中性粒细胞和内皮细胞的黏附(P0.05),极显著抑制fMLP刺激的中性粒细胞LFA-1和Mac-1的表达(P0.01),阻断fMLP刺激的中性粒细胞ERK磷酸化活性(P0.01),而对p38MAPK磷酸化活性无显著影响。【结论】咯利普兰可抑制中性粒细胞和内皮细胞黏附,其机制与阻断中性粒细胞ERK磷酸化进而抑制LFA-1和Mac-1表达有关。     

GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞自噬与凋亡的影响

【目的】细胞自噬和凋亡存在着相互制约,p38MAPK信号通路作为细胞凋亡的主要调控通路之一,也对细胞自噬存在促进和抑制的双重作用。已有研究表明,促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)对细胞自噬与凋亡均有影响,但作用机制尚不明确。故探究GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞(pGCs)自噬与凋亡的影响及其机理,为解决母猪的产子率以及同期发情等问题提供参考。【方法】从猪卵巢中提取卵巢颗粒细胞,进行体外培养。1、探究GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间:按孵育GnIH时间梯度(0min、10 min、30 min、60 min、90 min)分组,用Western blot检测猪卵巢颗粒细胞p38与p-p38的蛋白表达量变化;2、验证GnIH对p38MAPK信号通路的影响:按(空白对照、GnIH、p38激活剂(U-46619)、U-46619+GnIH)分组,用Western blot检测p38与p-p38的蛋白表达量变化;3、探究不同浓度GnIH对自噬和凋亡的影响:按(空白对照、10-6 mol·L-1 GnIH...     

基于信号通路p38 MAPK探讨疏风宣肺汤对大鼠慢性支气管炎模型TNF-α的影响

目的 观察疏风宣肺汤对慢性支气管炎大鼠血清以及肺组织中肿瘤坏死因子（tumor nercrosis factor-α,TNF-α）的影响。方法 将60只SPF级大鼠,随机分为空白组、生理盐水组、宣肺止咳合剂组和疏风宣肺汤组,每组15只;空白组正常饲养,余组采用脂多糖-香烟烟雾诱导法造模成功后分别予以生理盐水、宣肺止咳合剂、疏风宣肺汤灌胃,1周后行腹主动脉采血,剪下右肺,检测血清中TNF-α浓度,肺组织中TNF-αmRNA、TNF-α蛋白以及p-p38 MAPK蛋白的表达。结果 在药物干预7 d后,各组大鼠血清中TNF-α浓度以及肺组织中的TNF-α mRNA、TNF-α蛋白、p-p38 MAPK蛋白的表达差异性均有统计学意义（P<0.05）。与空白组相比,疏风宣肺汤组,生理盐水组、宣肺止咳合剂组中各检测指标差异有统计学意义（P<0.05）;与生理盐水组相比,疏风宣肺汤组和宣肺止咳含剂组差异有显著性统计学意义（P<0.01或P<0.05）。结论 疏风宣肺汤能显著降低慢支大鼠血清中TNF-α浓度以及肺组织TNF-α mRNA、TNF-α蛋白、p-p38 MAPK蛋白表达,减少p38 MAPK信号通路的活化可能是疏风宣肺汤有效防治慢性支气管炎的机制之一。     

O-GlcNAc对冷应激下小鼠骨骼肌卫星细胞Caspase-3的影响

O-连接的N-乙酰葡糖胺糖基化修饰(O-GlcNAcylation)是一种存在于蛋白质Ser/Thr上的翻译后修饰,主要是由OGlcNAc催化转移酶(简称OGT)和O-GlcNAc水解酶(简称OGA)调控的动态过程。其过程与磷酸化相似,在多种细胞过程中扮演着重要的信号转导通路角色,并与神经退行性疾病、Ⅱ型糖尿病、癌症等许多疾病的发病机理密切相关。主要是在低温应激下,通过抑制剂来调控OGT和OGA,间接调控小鼠骨骼肌卫星细胞内O-GlcNAc的含量,来探讨O-GlcNAc对骨骼肌卫星细胞凋亡的作用。实验分为正常对照组、OGA高表达组、OGT高表达组,经过常温(37℃)和亚低温(32℃)不同条件的处理,采用ELISA方法检测Casp-3指标的变化。结果显示:冷应激处理后,人为调控骨骼肌卫星细胞内O-GlcNAc的含量后,所检测的指标有明显差异(P0.05)。结果说明:在低温应激条件下,O-GlcNAc降低会促进细胞凋亡,从而降低了小鼠骨骼肌卫星细胞的抗应激能力,对骨骼肌卫星细胞造成了一定的影响。     

基于p38MAPK表达的烟草毒理学评价

利用2个基因型烟草卷制的单料烟Y-1和Y-2,分别对SD大鼠进行60 d的烟雾暴露,构建出COPD动物模型,分别于30,60 d,各处理组取右肺组织行H.E.染色、组织病理学评分,免疫组化法分析p38与p-p38的表达水平。结果表明,与健康大鼠相比,烟熏大鼠肺组织呈现出典型的COPD病理变化,p38的表达及其磷酸化水平均显著升高(P0.05);与Y-2组相比,Y-1组的p38表达与活化水平明显上调(P0.05)。COPD大鼠肺组织p38的表达、激活与烟草的基因型密切相关,这可能是由于不同基因型烟草的化学成分存在较大差异,p38有可能作为烟草导致特定机体损伤毒理学效应的一个潜在标志物。     

TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

【目的】卵泡抑素（Follistatin）能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组 Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%-80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·mL^-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-time qPCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因MyoD和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察,传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形,一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁,细胞略有变长。2 d后细胞继续增多,且呈长梭形。3 d后细胞数目增加,个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加,细胞变粗,个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化,细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示,95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达;CCK-8检测细胞增殖分析表明,不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后,各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P＜0.01),且10 ng·mL^-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显,为最佳处理浓度;与对照组相比,10 ng·mL^-1 Follistatin处理组的MyoD基因表达量显著下降(P＜0.05),PCNA基因表达量显著升高(P＜0.05),Myf5基因表达量显著升高,TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P＜0.05),且Smad3基因表达量极限著升高(P＜0.01);Western blotting检测蛋白表达水平结果表明,与对照组相比,TGF-β、Smad2 和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·mL^-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。     

猪骨骼肌卫星细胞体外培养

探索和建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。结果表明,通过机械法与酶消化法相结合的方法,15%血清完全培养液分离、培养细胞效果最好,对培养细胞进行了形态观察、生长曲线测定、染色体分析。结果表明,培养的细胞具有正常的大小、形态和染色体数目,该方法所获得的猪骨骼卫星细胞可在体外稳定培养,为有关实验提供充足的猪骨骼卫星细胞。     

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。     

宰前热应激对肉鸡胸肉氧化损伤和蛋白质功能特性的影响

【目的】研究宰前热应激对肉鸡胸肉pH、脂肪氧化和蛋白质氧化的影响,探讨热应激影响宰后肌肉蛋白质功能特性的机制。【方法】将30日龄AA肉鸡由（25±1）℃突然暴露在（40±1）℃高温中,并分别持续0、1、2、3和5 h后,各处理组中随机抽取10只,宰杀后剥取的胸肌在4℃条件下成熟24 h,测定鸡胸肉的pH、脂肪氧化产物MDA、蛋白羰基值和蛋白质功能特性的变化。【结果】与对照组相比,热应激处理组的鸡胸肉pH30min、pH24h呈现下降趋势（P＜0.05）,3 h和5 h处理组提高了胸肉脂肪氧化程度(P＜0.01),2、3和5 h处理组胸肉肌浆蛋白和肌原纤维蛋白氧化程度高于对照组(P＜0.01),热应激时间由1 h到5 h,胸肉蛋白质溶解度呈下降趋势,肉汁损失、压榨损失和煮制损失呈增加趋势,热应激处理组胸肉肌原纤维蛋白凝胶具有较低的硬度和弹性(P＜0.01),热应激2、3和5 h处理组胸肉肌原纤维蛋白凝胶保水性较对照组差(P＜0.01)。【结论】宰前热应激引起宰后肉鸡胸肉的pH下降,促使肌肉脂肪和蛋白质氧化程度加剧,导致胸肉蛋白质溶解度和持水能力降低,对肌原纤维蛋白凝胶特性造成不利影响。     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分...     

Signaling Pathways and Molecular Mechanisms of Oxidative Stress in Skeletal Muscle

Oxidative stress is a major factor affecting animal health and production performance. This paper briefly introduced the signaling pathways(i.e. NF-κB signaling pathway, MAPK, AP-1 and PGC-1α) of oxidative stress and the main genes regulating the signals of oxidative stress in skeletal muscle, providing a theoretical basis for reducing oxidative stress damage.     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外原代培养的试验研究

对大鼠骨骼肌卫星细胞体外原代培养方法进行研究,以得到高纯度的骨骼肌卫星细胞,为转基因等试验研究提供充足的试验材料。用0.1%Ⅱ型胶原酶消化法从18日龄SD大鼠后腿部肌肉分离出骨骼肌细胞并培养5日,再利用差速贴壁法分离得到高纯度的骨骼肌卫星细胞。研究结果表明,采用此方法分离得到纯度较高的骨骼肌卫星细胞,细胞增殖快,生长良好。     

姜黄素通过Nrf2信号通路对H2O2诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的缓解

[目的]验证姜黄素是否能够通过转录因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)信号通路减轻H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激,为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的氧化损伤提供理论依据.[方法]培养奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T),用500μmol·L-1 H2O2处...     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。