乳酸乳球菌acmAas基因的克隆与基因中断突变株特性研究

克隆了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株AS1. 2829的1种主要细胞壁自溶素-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶的编码基因acmAas,并对其编码蛋白AcmAas的结构进行了预测,发现该蛋白由1个具催化活性的N-末端和1个具细胞壁锚定活性的C-末端结构域组成,其中C-末端又由3个LysM(1ysin motif)结构域组成,具有典型的βαβα型二级结构.进一步通过体外在acmA基因中引入红霉素抗性基因(Emr)而构建具有与宿主菌染色体acmA基因进行整合作用的重组基因,并导人宿主菌后筛选得到发生染色体整合重组的重组菌株MB257,对该菌株的形态与生长特性进行了初步研究,结果表明该菌株所携带的acmAasN-lysm1基因在保留其N端结构域和1个lysM编码区后,其编码产物可发挥其完整生物学活性.     

牛乳源金黄色葡萄球菌Efb基因的克隆与序列分析

对分离自新疆的奶牛乳源金黄色葡萄球菌,提取分离菌株的基因组DNA,参考GenBank中发表的细胞外纤维蛋白原结合蛋白(Efb)基因序列,设计特异性引物经PCR扩增得到长432 bp的Efb基因.对新疆三个不同地区分离的9株金黄色葡萄球菌分别进行Efb基因的克隆和序列分析,对Efb蛋白的氨基酸序列分析结果表明:新疆三个不同地区Efb蛋白氨基酸的同源性为91.0％～100％,与其他地区分离菌株的同源性为86.5％～100％,差异性较小.该结果表明,Efb基因在该菌进化和流行过程中是保守的.     

植物乳杆菌Uvs44酪氨酸脱羧酶基因的克隆与序列分析

酪氨酸脱羧酶与发酵食品中酪胺的产生密切相关。根据GeneBank中乳酸菌酪氨酸脱羧酶基因序列设计一对特异性引物,采用PCR扩增的方法克隆并测定了植物乳杆菌Uvs44酪氨酸脱羧酶的核苷酸序列。结果表明：克隆的酪氨酸脱羧酶基因大小为744 bp,与目前已知的四株乳酸菌酪氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列比对结果表明：植物乳杆菌Uvs44与Lactobacillus brevis IOEB 9809的亲缘关系最近,为98.3%,与Enterococcus hirae 158的亲缘关系最远,为78.8%,不同乳酸菌的酪氨酸脱羧酶基因之间存在普遍的序列相似性,可为进一步构建酪氨酸脱羧酶基因缺失工程菌奠定基础。     

奶山羊β-乳球蛋白基因及其调控区的克隆和序列分析

从奶山羊组织提取基因组 DNA,根据已发表的山羊 β-乳球蛋白基因 (BLG)序列设计引物 ,用高保真长模板PCR法克隆得 6个奶山羊 BLG基因片段。这 6个基因片段的大小和部分限制性酶切图谱与已发表的山羊 BLG基因相同。部分序列测定结果显示 :6个奶山羊 BLG基因片段与山羊 BLG基因相应片段的同源性为 99%。进一步序列测定结果表明 :奶山羊 BLG基因 5′调控区与山羊、绵羊和牛的同源性分别为 99%、95%和 90 % ,3′调控区与这些动物的同源性分别为 99%、97%和 92 %。在乳腺特异表达调控元件集中的 -4 0 6bp区域内 ,奶山羊 BLG基因与山羊 BLG基因有 2个碱基的差异。所克隆的奶山羊 BLG基因调控区与山羊 BLG伪基因显著不同 ,其同源性仅为 83 % (上游调控区 )和88% (下游调控区 )。这些结果表明 :不同种动物的 BLG基因是高度保守的 ,高保真 PCR克隆的奶山羊 BLG基因调控区可用于乳腺特异表达载体的构建     

猪IRGC基因的克隆与序列分析

[目的]对猪IRGC基因进行序列分析,为进一步研究其功能奠定基础。[方法]采用EST信息和测序相结合的方法分离了猪IR-GC基因,并与人、牛、犬和猩猩IRGC基因进行序列相似性分析。[结果]获得了1 558 bp的cDNA序列,其登录号为EU703776,与人、牛、犬和猩猩IRGC基因的序列分别有86%、90%、91%和84%的相似性。序列分析表明,该基因编码的464个氨基酸与人、牛、犬和猩猩的相似性分别达到了90%、93%、95%和90%。[结论]成功提取了猪IRGC基因,其具有人、牛、犬和猩猩类似的结构和功能。     

四棱豆纤维连接蛋白基因部分序列克隆与分析

利用已报道的FNDC基因序列的保守区域设计引物,用所设计的引物扩增四棱豆FNDC基因的部分序列,将序列提交GenBank,获1个登录号FJ176925.通过对该序列的同源性比较分析发现,该序列与目前数据库中山豆根YP_001511236序列具有明显的同源性.该序列在112～651 bp片段上包括了1个开放性阅读框,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA.将ORF处的氨基酸序列继续进行生物信息学的分析,对其进行的1级结构分析和2级结构分析中,表明该序列是一个酸性蛋白,亲水性较弱,疏水性较强,信号肽序列为第23位～第45位,亚细胞定位最大可能性为定位于细胞外.含有N型糖基化位点,蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,C-末端锚定微体信号,纤维素结合结构域.主要以α-螺旋,不规则盘绕和延伸链为该蛋白最大量的结构元件,β-折叠散布于整个蛋白质中.     

番鸭IFN-α基因的克隆与序列分析

从经免疫的番鸭外周血分离淋巴细胞，经PHA刺激培养后提取总RNA，采用RT－PCR的方法，按照GenBank中序列号为X84764鸭I型IFN（DIFN1）基因设计引物，成功扩增出番鸭IFN基因，命名为MDIFN－α，包含编码MDIFN－α成熟蛋白全部核苷酸序列。DIFN1开放阅读框架（ORF）有576个核苷酸，编码191个氨基酸，其中切除信号肽的IFN－α为成熟DIFN1，共有486个核苷酸组成，编码161个氨基酸。MDIFN－α（含有不完整的信号肽）与X84764的核苷酸同源性为97．7％，推导氨基酸同源性为95．7％，结果显示，MDIFN－α可能为鸭I型IFN一个新的亚型。     

F4菌毛FaeG基因的克隆与序列分析

[目的]克隆F4菌毛FaeG基因,并对其进行序列分析。[方法]利用PCR方法从6株标准F4菌株中扩增FaeG基因片段,测序后用DNAStar软件进行分析和拼接,并与已发表的F4菌毛基因序列进行分析和比较,绘制基因进化树,比较它们之间的同源性和进化关系。[结果]试验成功扩增出FaeG基因片段;所扩增的6株已知血清变异型F4大肠杆菌与标准F4菌株同属于各自基因型,且F4ab与F4ac间的进化关系比与F4ad菌株间的近。[结论]通过该研究可推测F4菌株3个血清变异型的检测不仅可用单因子血清,而且可从DNA水平上进行检测。     

TK酶基因在乳酸乳球菌中的表达

利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相...     

香蕉中抗病基因相似序列的克隆与分析

根据植物抗病基因编码氨基酸序列的核苷酸结合(nucleotide binding site,NBS)和富含亮氨酸重复区(leucine-rich repeat,LRR)等保守区域的特点,设计PCR简并引物,从香蕉华农7号中克隆得到1个1 139bp的DNA片段.BLAST分析发现,其编码的氨基酸序列与多种植物来源的NBS-LRR类抗病蛋白及抗病蛋白同源物的相似性为40%～50%,并具有NBS-LRR类抗性基因所拥有的保守结构域:P-环、激酶2a、激酶3a和疏水结构域等区段.该抗病基因相似片段可作为分子标记来筛选香蕉的抗病基因.     

Cloning and Sequence Analysis of gyrB Gene of Fluoroquinolones-resistant Salmonella Isolated from Chickens

Nine strains resistant to five fluoroquinolones (Ciprofloxacin, Ofloxacin, Enrofloxacin, Danofloxacin,Sarafloxacin) were isolated from clinical samples and extracted the chromosomal DNA of these strains. Designed primers to amplify the Quinolone-resistance-determining region (QRDR) of gyrB gene, then the PCR products were cloned and the sequence was analyzed. In comparison with the standarded strain NCTC5776, no mutation was found in the QRDR of gyrB gene of all resistant strains. The result indicated that the QRDR of gyrB has little relationship with fluoroquinolone resistance to salmonella.     

文昌鸡PRL基因的克隆及序列分析

为研究文昌鸡催乳素基因的分子生物学特性和就巢机理,提取文昌鸡全血总DNA,利用特异性引物PCR技术获得文昌鸡PRL基因,将其克隆至pGM-T载体上,并测序分析.结果表明,文昌鸡PRL基因与GenBank 上已公布的白来航、泰和丝羽乌骨鸡核苷酸序列同源性分别为93.3%和93.5%,而氨基酸序列同源性均为89.6%;与其...     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

茶卷叶蛾寄生真菌球孢白僵菌几丁质酶基因的克隆与序列分析

球孢白僵菌是最重要的虫生真菌之一,在农林害虫生防中发挥着重要的作用。本研究从茶卷叶蛾球孢白僵菌JYBb201-11菌株中克隆了几丁质酶Bbchit1基因(GenBank登录号:HQ435871)。根据GenBank上昆虫病原真菌几丁质酶基因序列同源性设计引物,分别进行DNA-PCR和总RNA-RT-PCR反应,对得到的目的片段,回收纯化后通过PMD18-T载体转化到大肠杆菌DH5α中,获得几丁质酶基因序列的重组质粒PMD18-chit,并测序。结果表明,DNA-PCR和总RNA-RT-PCR获得的基因序列完全一样,都是一个完整ORF序列,含1 047bp核酸序列,编码348个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸,成熟蛋白理论分子量约为36.78kD,理论等电点为5.95。该蛋白序列中包含2个保守区域,即底物结合区域(SIGG)和几丁质的活性位点(DGIDIDIE),该蛋白可归为几丁质酶18族V类。氨基酸序列同源性分析表明,球孢白僵菌JYBb201-11菌株几丁质酶与球孢白僵菌Bb0062菌株(AAN41259)和NCIM1216菌株(ACF32998)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性都达99.43%;与球孢白僵菌MTCC 2028菌株(ACZ28129)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性达98.28%。     

木豆Actin基因片段的克隆及序列分析

根据大豆Actin基因的保守序列设计一对引物Primer 1和Pri mer 2,以木豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PMD-18T载体。阳性克隆经PCR检测后测序,序列分析结果表明,该片段长302bp,编码100个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在89%以上,其中与大豆的同源性达94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上。     

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因在乳酸乳球菌中的异源表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏好性,在不改变编码蛋白的基础上,优化设计并合成枯草芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因,将其与大肠埃希菌 乳酸乳球菌穿梭质粒pAMJ399连接,构建重组质粒pAMJ399 PIPLC,并电转化至乳酸乳球菌中进行诱导表达。SDS PAGE分析显示：重组蛋白以可溶性蛋白的形式分泌于胞外,分子质量约35 ku,与预期蛋白大小一致。重组蛋白在PI 李斯特氏菌显色平板上显现明显的乳白色晕圈,证明重组蛋白具有酶活性,磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI PLC）在重组乳酸乳球菌中成功获得表达。通过优化培养条件,以2%转接量,在含有1%红霉素抗性的GM17液体培养基中,于32 ℃静止培养24 h,测得培养基上清液中PI PLC的浓度为1.092 μg·mL-1。     

气相色谱法测定乳酸乳球菌脂肪酸

为了建立气相色谱法分析乳酸乳球菌脂肪酸方法,试验参照不同文献所提供的甲酯化方法对乳酸乳球菌进行甲酯化处理,通过对其气相色谱图中相同峰的峰面积进行比较,对比各个甲酯化方法的的效果。并对乳酸乳球菌MG1363进行气相色谱分析。结果表明,在对几种甲酯化方法进行比较后,发现酸碱结合法甲酯化法不适合乳酸菌,而三氟化硼甲酯化法明显优于酸催化与碱催化甲酯化法。并且测定出乳酸乳球菌MG1363的主要脂肪酸种类。结果表明,三氟化硼催化甲酯化法最适于乳酸乳球菌脂肪酸。乳酸乳球菌MG1363中除含有14和16C等脂肪酸外,还含有一种19C的环丙烷脂肪酸。     

蒙桑肌动蛋白基因的克隆与序列测定

为蒙桑基因表达与调控模式的研究以及蒙桑资源的利用提供参考,进行了蒙桑肌动蛋白(actin)基因的克隆与序列测定。结果表明:蒙桑actin基因mRNA序列大小为1 699bp,其中基因编码区1 134bp(GenBank登录号:KF031062),编码的377个氨基酸残基与其他植物的一致性在98%以上。该基因和川桑基因组中其他4个actin基因外显子数量和长度相同,但内含子差异极大,其CDS与桑树Morus010751(EXC30503)的一致性达到98%,氨基酸一致性为100%。聚类分析将其归为Class II类,与来自桑属和毛果杨的actin基因最先聚合在同一分支。     

鹿源牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因的克隆与序列分析

对已发表的牛病毒性腹泻-黏膜病毒E2基因的核苷酸序列进行比较分析并设计引物,应用套武RT-PCR获得鹿源BVDV E2基因.测序分析结果表明:鹿源BVDV E2基因由1 122个核苷酸组成,编码374个氨基酸.与Oregon CV24、NADL、ZM-95、SD1、Osloss、S10、SH9、Changchun184、Shitara、Deer-GB1核苷酸和推导氨基酸同源性分析表明:鹿源DVBV分离株与Changchun 184株及Osloss株的同源性较高,分别为99.2%和92.8%;与日本Shitara株的同源性为71.2%;与国际标准毒株CV24的同源性为74.6%.     

橄榄星室木虱乙酰胆碱酯酶基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR法和PCR法克隆到橄榄星室木虱乙酰胆碱酯酶基因(Ace)的2个片段,其中cDNA片段长66bp,翻译获得的氨基酸1～11位与家蝇等13种昆虫相应的序列相同或仅相差1个氨基酸,该序列在GenBank数据库中的接受号为DQ417582;基因组DNA片段长499bp,2个外显子连在一起与意大利蜜蜂等13种昆虫相应基因的氨基酸同源性均高于88%,该序列在GenBank数据库中的接受号为DQ425028。此结果为进一步研究橄榄星室木虱对杀虫剂抗性的分子机理奠定了基础。