卵丘细胞对卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的影响试验

将从猪卵巢上获取的卵母细胞根据卵丘细胞层数的多少分为两类,并将这两类卵母细胞进行成熟培养、体外受精和孤雌激活,以验证两类卵母细胞的发育潜能.结果显示,将两类卵母细胞分别进行成熟培养时,优级卵的成熟率高于次级卵（67.42±177;1.52％vs 48.33±177;2.85％）,且差异极显著（P＜0.01）;将成熟的卵母细胞进行孤雌激活后,优级卵的囊胚率高于次级卵（58.00±177;2.88％ vs 41.00±177;6.40％）,且差异极显著（P＜0.01）,但囊胚总细胞教两者无显著差异（P＞0.05）;将成熟的卵母细胞进行体外受精后,优级卵的囊胚率、囊胚总细胞数均高于次级卵（18.00土5.70％ vs 4.25±177;2.31％,41.7±177;3.33 vs 36.2土2.10）,且差异极显著（P＜0.01）;进行受精卵孵育时,未去除卵丘细胞的胚胎卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均高于去除卵丘细胞的（88.14土7.48％ vs 58.69±177;2.89％,51.2±177;7.33％ vs 11.92±177;2.29％,41.7±177;3.33 vs 36.8±177;3.15）,且差异极显著（P＜0.01）.以上结果说明：卵丘细胞层数较多的卵母细胞成熟率高,且其孤雌和体外受精胚胎的发育潜能也好;卵丘细胞存在时,有助于卵母细胞的受精及以后的胚胎发育.     

卵丘细胞对辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

为了进一步探索辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟的方法,本试验以屠宰场绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集直径大于2 mm卵泡的卵母细胞,研究卵丘细胞对卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响。试验1,将一部分COCs经机械吹打脱除卵丘细胞成为机械裸卵(DOs),然后以4种方式培养,即COCs单独培养、DOs与COCs共培养(DOs(COCs))、DOs与卵丘颗粒细胞共培养(DOs(CCs)),以及DOs单独培养。试验2,根据包裹卵母细胞的卵丘细胞的完整性分为3组,有3层卵丘细胞紧密包围的卵母细胞复合体COCs3,有1-3层卵丘细胞包围的卵母细胞COCs1-3,无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞NOs,3组各自单独培养。结果表明:COCs组的成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率最高,分别为83.25%、41.75%和29.25%,卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟和随后的发育,COCs3组成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率分别为83.25%、42.50%和29.75%,显著高于COCs1-3和NOs组,卵丘细胞的完整性也影响着卵母细胞的体外发育,自然裸卵已失去体外发育能力。     

奶牛体外受精效果几种影响因素的研究

文章研究了卵巢的保存温度、保存时间、不同的培养液成分、培养方法等对奶牛体外受精后的卵裂率、囊胚发育率的影响.结果表明①采集的卵巢在37℃保存2h时,卵巢卵母细胞体外受精后的卵裂率(71.3%)和囊胚率(31.4%),与25℃保存组的卵裂率(75%)和囊胚率(30.7%)相比,差异不显著(P＞0.05);但与40℃保存组(55%和15%)和4℃保存组(47.8%和12%)有显著差异(P＜0.05);当卵巢保存6h时,25℃保存组的卵裂率(70.2%)和囊胚率(29.2%)均显著高于37℃保存组(50.9%和13%)(P＜0.05);与40℃保存组(30%和7%)和4℃组(30.1%和8.2%)差异极显著(P＜0.01);但与保存2 h组差异不显著.在25℃温度下,屠宰牛卵巢保存时间达到8h时,卵母细胞的卵裂率和囊胚率显著下降,分别为55%和14%.②作为早期胚胎的培养液,CRlaa的效果好于TCM-199.③50μl微滴组的卵裂率(71%)与微滴100μl组(75%)和500μl组(72%)无显著差异(P＞0.05),但囊胚率(15.8%)显著低于100μl组(32%)(P＜0.05);大体积培养组(2 ml)的卵裂率和囊胚率(55%和14.8%)显著低于100μl组和500μl组(P＜0.05).     

奶牛活体采卵与屠宰场卵巢卵子体外生产胚胎的效果比较

先利用屠宰场卵巢获得的卵母细胞进行体外培养试验.在建立了培养体系获得较稳定的囊胚率的基础上,再利用具有优良乳用遗传性状的老龄奶牛进行活体采卵(OPU),获得的卵子进行体外胚胎生产,对奶牛活体采卵与屠宰场卵巢卵子体外生产胚胎的效果进行了比较.同时对奶牛重复OPU的效果及OPU卵子的培养天数对妊娠率的影响因素等进行探讨,试图为研究和生产建立一个高效的活体采卵体外胚胎生产方法.结果表明:(1)活体采卵获得的卵母细胞从形态以及后期的发育情况均明显差于屠宰场卵巢获得的卵子;OPU法的卵裂率、囊胚率(70.5%、18.3%)明显低于从屠宰场卵巢获得的卵子的卵裂率、囊胚率(75.1%、34.8%)(P＜0.01).(2)不同个体采集卵子数量差异明显(5.92枚/头与1.4枚/头)(P＜0.05).(3)同一头奶牛每次采卵数之间无显著差异,但有波动性变化.(4)奶牛OPU卵子经培养在第6 d或第7 d发育至囊胚的胚胎移植妊娠率高于第8 d发育至囊胚的胚胎.     

高产、淘汰奶牛卵巢卵母细胞及性控受精卵体外培养研究

为充分利用高产奶牛优秀遗传性能,加快黑龙江省垦区奶牛平均年单产9t的进程,对年单产9t以上的淘汰奶牛进行了卵巢卵母细胞和性控受精卵体外培养研究。在屠宰场取3次卵巢,每次取2头供体牛的卵巢,显微镜下选择挑出113个A级卵母细胞卵丘细胞复合体,做了3个批次2个重复,每批次做3个试验:卵母细胞体外成熟培养试验;成熟卵子与性控冻精体外受精试验;受精卵体外发育培养试验。应用统计软件统计6组试验数据分析得出:卵母细胞成熟率为89%,卵裂率为75%,囊胚发育率为32.8%,高于参考文献的平均水平。     

换液培养对猪卵母细胞的成熟及胚胎体外发育的影响

通过后期去除激素培养比较了卵丘卵母细胞成熟及构建克隆胚后的发育情况,同时孤雌胚胎和体外受精胚胎体外培养48 h后全量换液,比较了其卵裂率和囊胚率之间的差异。结果显示,卵丘卵母细胞培养22h后换成不含激素的成熟培养液继续培养至44 h,其成熟率与对照组无显著差异(P0.05);后期克隆胚胎卵裂率和囊胚率与对照组均无显著差异(P0.05)。孤雌胚胎换液培养卵裂率高于未换液组,囊胚率低于未换液组,但差异均不显著(P0.05)。体外受精胚胎换液培养卵裂率以及囊胚率和未换液组差异不显著(P0.05)。本实验结果说明换液培养对卵母细胞的成熟及后续的体细胞克隆胚发育无显著影响,孤雌和体外受精胚胎换液培养对后期发育也无显著影响。     

卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

为探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的添加浓度及脱卵丘细胞时间对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响.试验通过在体外成熟液中添加不同浓度(0、10、15、20、30、40 ng/mL)的EGF来研究其对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响;在培养开始后的不同时间(18、24、38、44 h)进行脱卵丘细胞处理来研究不同时间脱卵丘处理对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响.结果表明,成熟培养基中添加10 ng/mL EGF能显著提高卵母细胞的卵裂率和囊胚率(P <0.05).共培组和独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞成熟率均低于44 h,但差异不显著(P >0.05);共培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率和囊胚率显著高于培养44 h(P <0.05);独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率与44 h无显著差异(P >0.05),但囊胚率显著高于培养44 h后脱卵丘细胞(P <0.05).添加10 ng/mL EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育较好;卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞可提高孤雌胚胎早期发育能力.     

水牛卵丘颗粒细胞凋亡与卵母细胞体外发育潜能的研究

为了探讨水牛卵母细胞体外发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡之间的关系,本研究将水牛卵母细胞体外培养22～24 h后,取其卵丘颗粒细胞,采用Annexin V-FITC法进行颗粒细胞凋亡染色,进行凋亡率的分析,并与卵母细胞的成熟情况和卵母细胞的评分及形成卵裂、囊胚的结果进行对照.结果发现,随着卵母细胞成熟时间的增加,卵丘颗粒细胞凋亡率升高;随着卵母细胞评分和发育潜能的降低,卵丘颗粒细胞凋亡率逐渐升高.由此表明,卵母细胞发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡密切相关,通过测定卵丘颗粒细胞的凋亡率可预测未成熟卵母细胞的发育潜能.     

输卵管和颗粒细胞单层对牛体外受精胚胎发育的影响

以屠宰场牛卵巢为试验材料,研究输卵管细胞单层(OCM)和颗粒细胞单层(GCM)对牛卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)后胚胎发育能力的影响。(1)从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs),并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3类:1级(≥4层);2级(2～3层);3级(0～1层)。作分别在IVM和IVC培养液中添加GCM(1×106个/mL)与不添加的对比试验。结果显示:添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率无明显影响(P>0.05);但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组(P<0.05)。(2)所有卵母细胞(包括COCs和裸卵)被随机分为3个组,在其IVM和IVC培养液中分别添加OCM、GCM或不添加体细胞(对照组)。结果显示:OCM和GCM组的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率均高于对照组(P<0.05),而两试验组之间差异不显著。     

卵丘细胞对猪卵母细胞成熟及发育的影响

本实验旨在研究有无卵丘细胞对卵母细胞成熟及其胚胎发育能力的影响。实验分别设裸卵组、卵丘细胞与卵母细胞共培养组、卵丘-卵母细胞复合体(COCs)组(对照组),检测猪成熟卵母细胞的存活率、极体率、孤雌激活后的卵裂率、囊胚率及各组卵母细胞的谷胱甘肽合成相关基因的表达。结果表明:COCs组卵母细胞经体外培养42 h后其存活率最高(95.76%),高于裸卵组(P<0.05)和共培养组(P>0.05);COCs组第一极体排出率为71.77%,高于共培养组和裸卵组(P<0.05);COCs组在后期发育中卵裂率与囊胚率高于共培养组和裸卵组(P<0.05),而共培养组的卵裂率及囊胚率高于裸卵组(P<0.05);与COCs组相比,裸卵组显著下调了GCLM、GCLC的表达(P<0.05),共培养组中GCLM的表达与COCs组无显著差异。研究结果显示,卵丘细胞对卵母细胞的成熟及发育均有显著影响,在卵母细胞成熟过程中,卵母细胞与卵丘细胞的缝隙连接受损会对卵母细胞的成熟效率产生影响,并且在卵母细胞后期发育中,缝隙连接的完整性与否会影响后期发育能力,并可推论出随着卵丘细胞的减少和缝隙连接的破坏,会造成谷胱甘肽合成基因表达降低,从而影响卵母细胞内的谷胱甘肽合成。     

猪肌肉卫星细胞的分离培养及生物学特性鉴定

以猪胎儿为材料,采用胶原酶消化法或组织块法培养胎儿背部最长肌获得了肌肉卫星细胞,该细胞体外可以传到9代以上。培养的细胞多呈纺锤体型和梭型,具有明显的方向性,呈典型的长轴平行排列。流式细胞仪分析结果显示,该细胞呈CD29、CD166、CD45、CD44阳性,CD71、CD34阴性。RT-PCR检测发现其表达Desmin、C-Myc、Nanog、Pcna、Oct4、Klf4,弱表达Myog,不表达Sox2、MyoD。免疫组化染色发现其表达Desmin等肌肉细胞的特异性标记,同时表达Nanog、Pcna等多能性细胞标记。本试验建立了一种简便高效的猪肌肉卫星细胞体外分离和培养方法,得到的细胞具有肌肉卫星细胞的典型生物学特性,同时表达间质干细胞和多能性干细胞的部分标记。     

猪十二指肠中生长抑素阳性细胞和免疫细胞发育的研究

应用免疫组织化学技术分别研究猪十二指肠生长发育过程中生长抑素(SS)阳性细胞、IgA阳性细胞和酸性非特异性脂酶(ANAE)阳性细胞数量的变化。结果表明,SS阳性细胞的发育模式与IgA阳性细胞和AENE阳性细胞的呈相反趋势。SS阳性细胞数量于3日龄开始增加,20日龄达到第一个高峰,然后于45日龄呈极显著降低(P<0 01),90日龄又呈显著上升趋势(P<0 05),至120日龄时又达到第二个高峰;从出生至3日龄猪十二指肠无IgA阳性细胞的分布,20日龄时IgA阳性细胞开始出现,45日龄IgA阳性细胞数量显著增加(P<0 05)并达最高峰,90日龄时又呈下降趋势;猪十二指肠AENE阳性细胞数量在3日龄及20日龄均极显著增加(P<0 01)。然后于45日龄开始显著减少(P<0 05)。结果表明猪十二指肠中SS阳性细胞的发育对免疫细胞的发育可能具有重要的调节作用。     

山羊PGCs用于分离与克隆类ES细胞

选择健康成年本地白山羊，自然发情，配种后44d取胎儿，以传统的原始生殖细胞（PGCs)分离与克隆的方法和PGCs与其胎儿生殖嵴周围组织细胞共同培养的方法获得类胚胎干细胞（类ES细胞），并对山羊类ES细胞在不同饲养层上进行培养。结果表明，采用传统方法与共培养的方法并添加细胞因子均能分离获得类ES细胞。分离获得的类ES细胞在同源（山羊）胎儿细胞饲养层上生长效果较好，可传4代或5代，而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上类ES细胞仅传3代。另外，共培养不添加细胞因子组仅获1个ES细胞集落，传代后丢失。     

几种鸡胚原代细胞的制备方法

在病毒分离、繁殖，中和试验及药物毒理试验中，细胞培养是经常被选用的技术。本文描述通过选择不同日龄的鸡胚，分别对皮肤上皮细胞、肝细胞和肾细胞进行了组织培养，确定了生长所需的培养液要求。认为１２日龄鸡胚适于皮肤上皮细胞的制备，１７～２０日龄鸡胚适合于肝细胞、肾细胞的制备，并确定了细胞生长的ｐＨ条件。     

胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展

生殖细胞来源于原始生殖细胞,其在体内的分化机制已基本清楚。随着生殖细胞研究的不断深入,通过体外诱导途径获得生殖细胞已成为现实。将胚胎干细胞体外分化为上胚层样细胞,进而分化为原始生殖样或原始生殖细胞。将它们迁移入胎儿生殖腺,具有减数分裂及产生精子能力,与卵子结合移入缺生精管的生殖腺的新生鼠可以产生健康后代。为此,体外诱导生殖细胞的成功,进一步阐明了胚胎干细胞向生殖细胞分化的机制,为更有效利用干细胞造福人类奠定了基础。     

肝脏细胞和胰腺细胞的发育与再生

肝脏和胰腺前体细胞都是由胚胎前肠内胚层细胞发育而来的。脊椎动物中,在高度保守的诱导信号和遗传调节因子作用下,肝脏和胰腺前体细胞特化,并获得器官功能和再生能力。由于对肝脏疾病和Ⅰ型糖尿病有重要的临床价值,肝脏、胰腺的发育和再生机制成为了研究热点。通过对不同模式生物的研究,揭示了进化上保守的诱导信号和转录因子诱导肝脏、胰腺细胞的分化机制,这为干细胞和前体细胞如何诱导分化为肝实质细胞和胰腺β细胞提供了理论依据。     

嗅鞘细胞对无血清培养诱导PC12细胞凋亡的作用

采用无血清培养诱导PC12细胞凋亡,研究嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cells,OECs)对去血清后诱导PC12细胞凋亡中的作用。通过MTT法检测细胞的活性,细胞形态学观察,以及结合流式细胞仪检测细胞的凋亡率,井对不同组细胞凋亡率进行比较。结果表明：①OECs培养上清对去血清后PC12细胞的存活有明显的促进作用;②从形态学上观察,OECs对去血清诱导PC12细胞凋亡有明显的抑制作用,使得细胞向死亡过渡受阻;②流式细胞对细胞周期分析,去血清诱导后的PC12细胞,大部分细胞滞留在G1期,细胞向S期过渡受阻,造成G1期细胞的堆积,它们所占比例分别为：73．6％,25．9％,0．5％;而OECs联合培养组所占比例：53％,42．3％,4．7％;OECs上清组：42．1％,52．2％,5．7％;正常有血清培养组：45,6％,41．4％,13％。凋亡细胞所占百分比分别为：60．3％,45,6％,37．4％,0．5％。     

饲养层细胞对胚胎干细胞的影响及其分离培养的影响因素

胚胎干细胞及其相关研究是生命科学领域中最有活力、最有影响力、最有应用前景的研究方向之一，它与遗传工程，转基因技术等相结合具有重大的理论意义与实践价值。饲养层细胞在胚胎干细胞分离培养的过程中起着异常重要的作用。作者结合实践经验就饲养层细胞对胚胎干细胞的影响进行了概述，介绍了饲养层细胞的分类，并分析了饲养层细胞分离培养的影响因素。     

影响山羊类胚胎干细胞分离克隆的因素分析

将本地槐山羊胎儿的原始生殖细胞(PGCs)与其生殖嵴周围组织细胞共同分离,经传代培养后获得了具有干细胞特征的山羊类ES细胞。结果表明高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基相比较,低糖DMEM更适宜于山羊类ES细胞的分离与克隆;类ES细胞在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上生长效果较好,可传4代或5代,而在小鼠成纤维细胞饲养层上,类ES细胞仅传3代;联合添加白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能显著提高山羊类ES细胞分离与克隆的效率;胎龄为30~45d的胎儿原代培养时可获得大量的细胞集落,克隆培养可传至5代,适合作山羊类ES细胞的分离培养。     

The B and T Cell Responses to Orf Virus Infection of Ovine Skin

Abstract— Local scarification and infection with orf virus induced an influx into the dermis of a significantly greater number of T cells than scarification alone. These cells accumulated underneath the early lesion caused by the scarification and later within epidermal pustules which formed as a result of infection. Cells of the γδ, T₄ and T₈ subsets were all implicated in this response. Dermal B cell numbers also rose in response to infection but relatively fewer B cells were found within pustules. Dendritic cells reactive for IgM were prominent under the initial lesion caused by scarification and dense aggregations occurred under the degenerating epidermis about 72 h after infection. Résumé— L'infection par scarification locale de virus de l'ecthyma contagieux du mouton a provoqué un influx de lymphocytes T dans le derme significativement plus important que lors de scarification seule. Ces cellules s'accumulaient sous les lésions précoces provoquées par la scarification et plus tard au niveau des pustules resultant de l'infection. Les lymphocytes T3, T4 et γδ, étaient impliqués dans cette reaction. Le nombre de lymphocytes B dermiques augmentait aussi en réponse à l'infection, mais peu d'entre eux étaient retrouvér dans les pustules. Les cellules répondant à l'lgM étaient majoritaires sous les seules lésions provoquées par scarification et des agrégations denses apparaissaient sous l'épiderme dégénéré 72 heures aprés l'infection. Zusammenfassung— Die lokale Skarifikation und Infektion mit dem Orf-Virus führte zum Einwandern von einer signifikant größeren Anzahl von T-Zellen in die Dermis, als die Skarifikation allein. Die Zellen akkumulierten sich unter der frühen Skarifikationsläsion und später innerhalb der epidermalen Pusteln, die sich durch die Infektion ergaben. Zellen der Gamma-delta-, T4-und T8-SubpopuIationen waren an dieser Reaktion beteiligt. Auch die Anzahl dermaler B-Zellen stieg als Antwort auf die Infektion, aber innerhalb der Pusteln wurden, relativ gesehen, weniger B-Zellen gefunden. Die auf IgM reaktiven Denritenzellen hoben sich unter der initialen Läsion durch die Skarifikation hervor, dichte Aggregationen fanden sich unter der degenerierenden Epidermis ungefähr 72 Stunden nach der Infektion. Resumen Infección e introducción por medio de multiples punturas cutáneas del virus Orf, produjo un mayor aflujo de linfocitos T en la dermis que punturas de manera aislada. Éstas células se acumularon debajo de la lesión primaria causada por las punturas y de forma tardía en las pústulas epidérmicas, las cuales se formaron como resultado de la infección. Las células del tipo yó de los subgrupos T4 y T8, se encontraron todas implicadas en esta respuesta. Los números de linficitos B en la dermis se vieron aumentados como reacción a la infección, pero menos en las pústulas, relativamente. Células dentríticas reactivas a la IgM fueron prevalentes en la lesión inicial por las multiples punturas, y 72 horas despues de la infección, se detectaron agregaciones densas que ocurrieron bajo la epidermis en degeneración.