秀丽白虾4种C型凝集素基因的克隆、组织表达与进化分析

C型凝集素是一类Ca² 依赖活性的糖蛋白,在虾蟹类的免疫防御中发挥着重要作用。采用RT-PCR及RACE技术首次克隆了秀丽白虾C型凝集素家族4个基因( EmCTL-1、EmCTL-2、EmCTL-3、EmCTL-4)的cDNA全长。这4个C型凝集素基因的cDNA全长分别为1 390、1 119、1 364和1 299 bp,分别含996、969、 1 026和1 044 bp的开放阅读框,各编码332、322、341和347个氨基酸的蛋白。其氨基酸序列与罗氏沼虾相应的C型凝集素的相似性分别为40%、37%、69%和73%, 与其他海水虾类的相似性在30%～41%之间。阳性选择模型分析显示虾类的C型凝集素基因在进化过程中经历了阳性选择。进化树分析表明,秀丽白虾的 C型凝集素基因与罗氏沼虾的亲缘关系最近,并且除EmCTL-4属于十足类C型凝集素亚群A外,其他均属于亚群C。组织表达分析表明,EmCTL-1主要在血液中表 达,EmCTL-2主要在性腺、血液和胸神经节中表达,而EmCTL-3和EmCTL-4则主要在精巢中表达。研究表明,秀丽白虾的C型凝集素基因具有较快的 进化特点,同时又具备凝集素行使免疫功能时必需的保守氨基酸残基及钙离子结合位点,精巢和血液是秀丽白虾C型凝集素基因主要的表达器官。     

一种凡纳滨对虾新的C型凝集素基因(LvLc2)的克隆及免疫应答特征

为有效地进行凡纳滨对虾病害防治和健康养殖,探究对虾天然免疫机制,为其免疫防控提供新思路,实验根据本课题组前期转录组结果提示,在凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了一个新的C型凝集素基因(LvLc2,GenBank登录号KR020738).生物信息学分析显示,LvLc2的ORF区全长465 bp,编码154个氨基酸(aa),5'...     

拟穴青蟹Cactus基因的cDNA克隆、序列及生物学功能

为获取拟穴青蟹Cactus基因cDNA全长、分析基本生物学信息,并初步探索其在病原物刺激下的免疫反应,实验采用RACE技术获得了拟穴青蟹Cactus(SpCactus)基因的cDNA全长序列,其cDNA全长为2 035 bp,开放阅读框(ORF)1 311 bp,编码436个氨基酸,分子量为46.01 ku。对蛋白理化性质进行预测发现,SpCactus为亲水性蛋白,等电点pI为4.91。经预测,SpCactus与其他物种的IκB蛋白具有相似的功能结构域。同源性比对结果显示,SpCactus与凡纳滨对虾和中国明对虾的Cactus蛋白同源性均高达62%,相似度为73%。系统进化树分析显示,SpCactus与甲壳动物聚为一支,与无脊椎动物聚为一大支。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现,SpCactus基因在拟穴青蟹不同组织中均有表达,肌肉中的表达量最高,其次为心脏、眼柄、血液和鳃,肝胰腺中的表达量最低。LPS和金黄色葡萄球菌刺激均能显著诱导SpCactus基因的表达。本实验成功扩增了SpCactus基因全长,并进行了生物信息学分析、理化性质预测,初步探讨了其生物学功能,为进一步研究其...     

合浦珠母贝C-型凝集素基因的序列特征和功能分析

通过EST筛选结合重测序法获得合浦珠母贝一种C-型凝集素cDNA的全长序列(命名为PoLEC1)。PoLEC1全长988 bp,5′-UTR为33 bp,3′-UTR为101 bp,开放阅读框为864 bp,编码287个氨基酸,分子量为31.68 ku,理论等电点约5.83。预测的氨基酸序列中含有信号肽(Met¹-Ser¹⁹)和糖结合位点。同源性分析结果表明,PoLEC1与其它物种C-型凝集素的的糖识别结构域序列的同源性在18.8%~28.6%,相似性在28.9%~50.0%之间。进化树分析结果表明,PoLEC1与栉孔扇贝聚为一支。组织表达分析表明,PoLEC1 mRNA在消化腺、外套膜、性腺、闭壳肌、肠、鳃和血淋巴组织均有表达,在消化腺中的表达分析表明,经溶藻弧菌刺激后2 h表达显著下调,而在4和24 h后表达显著上调。利用PoLEC1成熟肽构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行重组表达。制备包涵体后,用IDA HisBind 树脂纯化得到单一的重组蛋白,凝菌试验表明该蛋白对大肠杆菌有明显的凝集作用。     

罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因的克隆和分子特性分析

利用特异性引物,采用PCR扩增出分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株的cpsE基因,将其克隆到pMD19-T载体上,通过菌落PCR鉴定和利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定之后送测序公司测序,并利用生物信息学软件Clustal X 2.0、MEGA 4.1、Bioedit 7.0、TMHMM、NetPhos 2.0、NetNGlyc 1.0、SignalP 3.0 Server、PSIpred、SAM_T08以及CUSP等分析cpsE基因的分子特性。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌cpsE编码氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌亲缘性达100%,具有1个参与催化糖基元转运的Glycosyltransferases超级家族结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点3个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,且存在跨膜区。密码子偏爱性分析表明,罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性更接近真核生物。     

团头鲂NK-lysin基因鉴定和表达分析

为研究抗菌肽NK-LYSIN在团头鲂免疫系统中的可能功能,本实验从团头鲂转录组中钓取到2个NK-lysin基因(nkla和nklb),通过PCR扩增并测序验证其ORF序列。通过荧光定量PCR检测其在健康组织和嗜水气单胞菌感染后免疫组织中的表达,并构建其原核表达体系。结果显示,团头鲂nkla和nklb分别编码122和136个氨基酸,NKLA和NKLB均属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族成员,各含有6个高度保守的半胱氨酸及1个Sap B结构域。在健康团头鲂各组织中,nkla在脾脏中表达量极高,在肌肉和血液中表达量极低;而nklb则在肠中表达量较高,在头肾中表达量较低,在其他组织均有表达。nkla和nklb不同的表达模式暗示它们可能存在功能上的分化。经嗜水气单胞菌感染后,团头鲂nkla与nklb表达变化模式相似,头肾中,表达量在4 h时显著下降;肝脏中,表达量在4 h达到最高,而后回落到正常水平;在脾脏和肠中4 h时开始下降,72 h时达到峰值,暗示NK-lysin可能在团头鲂抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥重要作用。另外,本实验对nkla和nklb进行了原核表达,为进一步研究NK-lysin的功能奠定了基础。     

裙带菜和萱藻凝集素对刺参组织主要免疫酶活性的影响

研究刺参基础饲料中添加不同剂量裙带菜凝集素和萱藻凝集素对刺参酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LSZ)、过氧化氢酶(CAT)活性的影响。在基础饲料中分别添加0.58%、1.16%、2.32%裙带菜凝集素(质量分数);0.32%、0.64%、1.28%萱藻凝集素,以基础饲料饲组为对照,于投喂后第4、8、13、17天检测ACP、AKP、LSZ、CAT活性。结果显示,投喂17 d内,各实验组ACP活性随时间和剂量增加持续升高,ACP活性均高于对照组;LSZ活性则随时间延长持续升高,但萱藻凝集素各组活性在第17天有所下降,且LSZ活性与凝集素添加量成正比关系;裙带菜凝集素组CAT活性呈升高趋势,萱藻凝集素组呈先高后低规律变化。     

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。     

香鱼白细胞介素17C基因克隆及鳗利斯顿氏菌侵染后的时空表达

为了解香鱼白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)的序列特征、系统发育及其与鳗利斯顿氏菌侵染的相关性,实验采用RACE-PCR方法扩增出香鱼IL-17C基因c DNA序列,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼各组织中IL-17C基因的表达变化。结果显示,香鱼IL-17C基因c DNA序列全长1 087 bp,含534 bp的开放阅读框,在3′端非编码区存在7个m RNA不稳定信号(ATTTA)。预测该基因编码177个氨基酸,N端19个氨基酸为信号肽序列,成熟蛋白中含有8个半胱氨酸残基。系统进化树分析显示不同物种的相同IL-17亚型聚为一支,香鱼IL-17C与其他脊椎动物IL-17C聚为一支;同源比对结果显示香鱼IL-17C与虹鳟的IL-17C1和IL-17C2亲缘关系最近,相似性分别为40.72%和33.51%。q RT-PCR检测显示IL-17C基因在健康香鱼的心、肝、脾、头肾、鳃、脑、肌肉和肠等组织中均有表达,鳃和头肾中表达量较高。经鳗利斯顿氏菌侵染后,香鱼肝脏中IL-17C基因表达变化最大,菌侵染8 h时的表达量为对照组的9.17倍;其次为脾,菌侵染4 h时的表达量为对照组的6.69倍。研究表明,香鱼IL-17C基因的表达与病原菌侵染密切相关,可能在免疫功能中具有重要作用。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

三角帆蚌CAT基因cDNA全长克隆及表达分析

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)首次克隆了三角帆蚌过氧化氢酶(CAT)基因的cDNA全长序列,为2 804 bp,包含112 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),1 303 bp的3′UTR和1 388 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)。ORF区共编码462个氨基酸,推算的分子量约为52.7 ku,理论等电点为6.35。多序列比对结果显示,有一段CAT氨基酸高度保守的催化位点序列FDRERIPERVVHAKGAG。三角帆蚌CAT基因有12个与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合的氨基酸残基,分别是Asp107、His153、Phe157、Ser160、Arg162、Asn172、Try174、Lys196、Val261、Trp262、His264和Try317,其中第261位和第264位的氨基酸在不同物种间有所区别。比对结果得到的三角帆蚌CAT基因的氨基酸序列,与软体动物的CAT基因相似性高达99%,与虾类、鱼类、两栖类、哺乳类的CAT基因相似性也达到98%~99%,可推断属于CAT3。利用CAT基因推断得到的氨基酸序列构建NJ系统树,分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,再与虾类聚在一起,然后依次与鱼类、两栖类和哺乳类聚在一起。荧光定量结果显示,CAT基因在三角帆蚌的7个组织均有表达,其中在肾中的表达量极低,在血液中表达呈上调趋势且明显区别于其他组织,在另外5个组织中总体上呈现不统一的先上调后下调的趋势。     

海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆及其原核表达

从已构建好的海带雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9)。首先根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术,自雄配子体中克隆了一条长831 bp的cDNA序列,其中开放阅读框450 bp,5′-非翻译区182 bp,3′-非翻译区199 bp且具有明显的poly(A)尾巴。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体的完全一致。蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/LytB domaincontaining protein:一种孢子形成时起作用的蛋白质)具有30%相似性,故暂命名为孢子形成相关蛋白基因(sporulationrelated protein gene,srp)(GenBank登录号:EF490313)。然后构建了srp基因原核表达载体pET-28a-srp,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行表达,获得了分子量大小约19.3 ku的目的蛋白,且表达量与诱导物IPTG的量成正比。通过高效液相色谱-质谱分析证实,重组蛋白的氨基酸序列与推测的目的蛋白一致。最后纯化重组了SRP蛋白并制备其多克隆抗体,利用该抗体并运用Western印迹技术,在海带配子体中证实SRP蛋白的存在。     

凡纳滨对虾C型凝集素（LvLc1）的特征和活性分析

C型凝集素是一种依赖于Ca~(2+)而发挥功能的糖蛋白,在一线的固有免疫防御过程中发挥着重要作用。围绕对虾C型凝集素开展深入研究,不仅可以丰富无脊椎动物固有免疫学内容,还有望将其开发为具有免疫增强效果的活性饵料,应用于对虾的健康养殖。本实验根据实验室前期转录组信息提示克隆获得了凡纳滨对虾一种新的C型凝集素基因(LvLc1,Gen Bank注册号:KY937940)。生物信息学分析显示LvLc1基因的开放阅读框全长891 bp,编码296个氨基酸,该基因编码的蛋白质含有一个保守的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD),该结构域中具有潜在的半乳糖结合位点(QPD motif),进化发生分析显示LvLc1与来自节肢动物的甘露糖结合凝集素家族成员聚类在一起。对LvLc1基因的CRD结构域进行了原核重组表达与蛋白活性分析研究,结果显示:重组目的蛋白(rLvLc1)在Ca~(2+)存在的条件下,对多种病原菌(G~+、G~–和真菌)具有凝集作用,其凝集活性可被半乳糖、甘露糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制。研究表明,LvLc1作为C-型凝集素家族一个新成员,可能通过重要的模式识别受体作用,参与机体应答病原微生物侵染的防御过程。     

虾夷扇贝C型凝集素母源传递与抑菌作用的初步研究

为研究虾夷扇贝C型凝集素的母源传递及其抑菌作用,实验运用qRT-PCR技术检测了经鳗弧菌刺激后虾夷扇贝卵巢中C型凝集素的表达模式,比较分析了C型凝集素基因在正常虾夷扇贝和鳗弧菌刺激的虾夷扇贝所产的卵及其胚胎发育前期的存在与变化;通过抑菌实验研究了卵胞浆中C型凝集素抑制细菌存活的作用.结果表明,鳗弧菌刺激能够诱导虾夷扇贝卵巢中的C型凝集素mRNA表达量显著变化,最高表达量出现在刺激8h后,为对照组的6.2倍;母体中C型凝集素可以传递给卵和胚胎,刺激组表达量极显著高于正常组,且表达量都随胚胎发育逐渐降低,至受精36 h时分别为正常对照卵的0.3和0.2倍;蛋白终浓度为200和400 μg/mL的卵无细胞体系都具有一定的抑菌作用,与C型凝集素家族抗体反应后,细菌存活率显著上升,说明母源C型凝集素在抑制细菌存活方面发挥了重要的作用.     

鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达

A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene (omp) of Aeromonas hydrophila . With the specific primers, a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR .The target fragment was inserted into the linearized pGEM-T easy vector. After enzyme restriction and sequencing analysis,the nucleotide data had been further analyzed by DNAman and ClutalW software. The analysis results showed that the cloned DNA fragment had a longest open reading frame (ORF) of 1035 nt,it predicted to be encoded a 344 aa protein with the molecular weight of 36 kD. Hydrophobicity analysis suggested that the protein was highly hydrophilic, especialy at the first 24 aminoacid, this region could function as signal peptide. The homologious comparison proved the cloned gene had 96% homology to the sequence of the omp gene, and the alignment of the amino acid sequence was 98% . The recombinant plasmid was constructed with the target gene and the expressing vector pGEX-4T-1 and then was transformed into E. coli BL21（DE3）by BamH and Sal I .The fusion protein was expressed under the IPTG inducing condition,and exhibited about 62 kD in size,very close to the predicted molecular weight of GSTMOMP, furthermore,the fusion protein was specifically recognized by antiserum which raised against the major outer membrane protein of AHML316. Considering all these together, it proved that the cloned gene represented the major outer membrane protein gene of AHML316, and the expressed gene products shared identical antigenicity with the natural main outer membrane protein,and also provided technical support for developing an advanced gene engineering vaccine against Aeromonas hydrophila.     

A novel mannose-binding lectin from plasma of Labeo rohita

A new mannose-binding lectin was purified from plasma of freshwater fish, rohu (Labeo rohita) by ammonium sulphate precipitation followed by DEAE-cellulose ion-exchange chromatography. The hemagglutinating activity is strong for neuraminidase-treated rabbit erythrocytes. Mannose, glucose and their derivatives inhibit hemagglutination. The apparent molecular weight was determined to be 210 kDa in native PAGE. Analysed on SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions, the protein migrated as a single band of mol.wt. 40,000. The lectin is acidic in nature showing a pI of 4.5. It is a glycoprotein containing complex glycan part as indicated by carbohydrate analysis using high-pressure anion exchange chromatography with a pulsed amperometric detector. The N-terminal sequence (WLNGIGTQIPMKITT) shows no significant homology with known proteins. It appears to be a C-type lectin as Ca²⁺ is essential for carbohydrate-binding activity. Methyl -α- D-mannopyranoside was found to be the most potent inhibitor among the monosaccharides and disaccharides tested. Purified lectin was found to induce intracellular superoxide production following opsonization of E. coli by its own macrophages. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

牙鲆趋化因子基因CXCL9的克隆、鉴定与表达分析

趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。     

罗氏沼虾RXR基因克隆及其对蜕皮相关基因的调控

为研究维甲酸类X受体 (RXR) 在甲壳动物蜕皮过程中的调控作用,实验采用RACE技术克隆获得罗氏沼虾Mr-RXR基因,通过实 时 荧 光 定 量 PCR (qRT-PCR)分析了Mr-RXR及其他蜕皮相关基因 (MIH、EcR、E75和CHIT) 在罗氏沼虾不同组织、不同蜕皮阶段的表达情况,并采用RNA干扰(RNAi)探究Mr-RXR对罗氏沼虾蜕皮相关基因表达的调控作用。结果显示,Mr-RXR基因cDNA全长2 241 bp (GenBank登录号MZ501612),包括36 bp的5′末端非翻译区 (UTR) 和719 bp的3′UTR,开放阅读框 (ORF) 为1 386 bp,共编码461个氨基酸。罗氏沼虾RXR氨基酸序列与甲壳动物同源性较高,存在保守的DNA结合域 (DBD) 和配体结合域 (LBD)。Mr-RXR在罗氏沼虾所有组织中均表达,精巢、眼柄、心脏等组织中表达量较高,其表达水平随蜕皮周期改变,眼柄和肌肉组织中均在蜕皮前期表达量最高,与EcR基因表达模式基本同步;E75和CHIT基因表达模式较为相似,眼柄和肌肉组织分别在蜕皮前期和蜕皮后期高表达;MIH基因仅在眼柄组织表达,且蜕皮间期表达量最高。采用3 μg dsRNA/g虾的剂量进行为期12 d的RNAi实验诱导Mr-RXR沉默,罗氏沼虾出现大量死亡,qRT-PCR显示,眼柄和肌肉中Mr-RXR干扰效率分别为79%和55%。眼柄组织中Mr-RXR基因沉默后,MIH基因表达未受影响,EcR、E75和CHIT基因表达水平显著降低,肌肉组织中,Mr-RXR沉默仅造成CHIT基因表达水平的显著下降,推测Mr-RXR可能通过影响EcR、E75和CHIT基因表达调控罗氏沼虾蜕皮过程。本研究结果将为甲壳动物蜕皮调控机制研究提供基础资料。     

中国明对虾C 型凝集素基因(Fclectin)的重组表达及活性分析

研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾先天免疫中重要的模式识别受体,在一定程度上参与了机体应答病原微生物的防御过程。