过表达青绿苔草滞绿基因CbSGR加速拟南芥叶绿素降解和衰老

根据全长转录组数据,克隆得到青绿苔草滞绿基因CbSGR(GenBank登录号:MN746439),其完整编码区全长为771bp,编码256个氨基酸。NCBI Nr数据库Blast结果显示,CbSGR属于STAY-GREEN超家族,系统进化分析表明CbSGR与油棕和海枣SGR的相似度最高。为研究CbSGR的转录激活特性,构建pGBKT7-CbSGR载体并转化Y2HGold酵母感受态细胞,其在三缺培养基(SD-Trp-His-Ade)上不能生长,表明CbSGR不具有转录激活活性。利用本生烟草瞬时表达方法观察亚细胞定位情况,结果表明CbSGR定位于叶绿体。利用花序侵染法转化拟南芥,过表达株系表现出黄化,叶绿素含量显著低于对照且净光合速率明显小于对照。荧光定量分析结果表明,过表达CbSGR转基因株系中光合效率相关的AtCAB1、AtPSAF、AtRCA基因表达量均显著低于对照,而衰老相关的AtNYC1、AtNOL、AtSEN、AtSAG12和AtSAG14基因表达量均显著高于对照,表明CbSGR的过表达降低了光合效率并加速了植物衰老。CbSGR是一个调节植物叶绿素降解和衰老的关键基因,为后续通过基因编辑等措施改良青绿苔草绿期奠定了基础。     

草地早熟禾PpGA20ox1基因的克隆及表达分析

利用RACE方法,从草地早熟禾叶片中克隆出1个GA20ox基因家族成员的cDNA序列,命名为PpGA20ox1,提交到Genbank,登录号为KX443595。PpGA20ox1开放阅读框长1095bp,编码含364个氨基酸的蛋白质序列;不含信号肽序列,为疏水蛋白,与黑麦草、小麦等物种的亲缘关系较近;用Gateway方法构建瞬时表达载体并注射烟草叶片观察亚细胞定位,发现其定位在细胞质和细胞核。用相对荧光定量qPCR方法研究基因的组织特异性及喷施赤霉素和烯效唑对基因表达的影响,结果表明PpGA20ox1基因在草地早熟禾叶片中表达量最高,根次之,叶鞘最少,且表达量受赤霉素和烯效唑抑制。     

日本结缕草滞绿基因 ZjSGR 对烟草的转化及功能分析

SGR 基因是植物体内调控叶绿素降解的关键基因之一,在调控植物衰老以及响应非生物胁迫等方面也发挥着重要的作用。 本研究利用 DNA 重组技术,构建 35S::ZjSGR:YFP 植物表达载体,并通过农杆菌介导的方法成功转化烟草。PCR 和 qRT-PCR 结果显示日本结缕草滞绿基因ZjSGR已整合到烟草基因组中,并能够在转基因烟草中高效表达。在正常生长环境下,转基因烟草表现出黄化的表型。与对照相比叶绿素含量较低,光合速率下降。亚细胞定位实验证明ZjSGR定位在叶绿体,透射电镜观察结果表明过表达ZjSGR基因使叶绿体发育异常,且有加速降解的趋势。qRT-PCR结果发现转ZjSGR基因的烟草中SAG113,SAG12,NCED和AAO3的表达量明显高于野生型,衰老进程明显加快。本研究证明ZjSGR可在调控叶绿素降解和衰老的进程中发挥重要作用。     

多年生黑麦草LpGCS基因克隆及其在烟草中的初步功能验证

本研究以多年生黑麦草‘高帽2号’叶片为试材,根据同源基因的CDS序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了多年生黑麦草γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因LpGCS。该基因全长为1674 bp(GenBank登录号:KJ551844),具有完整的开放阅读框(ORF),共1125 bp;对其氨基酸序列特性、结构以及与其他8种同源基因氨基酸序列间的同源性进行了研究,预测该蛋白分子量为42.86 kDa,属于不稳定类蛋白质,其蛋白质二级结构以α-螺旋为主;蛋白质氨基酸序列与其他8种同源基因氨基酸序列间同源性都比较高;此外,成功构建了该基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA-Ubi-LpGCS+和pCAMBIA-Ubi-LpGCS-,并通过农杆菌介导法获得转正、反义基因烟草。对转基因植株和野生型烟草进行镉离子胁迫试验,生理生化指标测试结果表明镉离子胁迫处理10 d后,转LpGCS+植株中MDA含量低于野生型,光合色素含量与POD、SOD、CAT活性均高于野生型;而转LpGCS-植株中MDA含量高于野生型,光合色素含量与POD、SOD、CAT活性均低于野生型。综上所述,LpGCS基因在烟草中的过量表达可以提高植株的耐镉胁迫能力,为进一步利用该基因转化多年生黑麦草培育抗重金属植株奠定基础。     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1 个1674 bp的开放阅读框,编码557 个AA,编码蛋白属于IIb 类WRKY 家族成员,含有1个WRKY 保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T₀代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T₁代转基因株系进行抗盐分析发现,在200 mmol·L^-1 NaCl 处理14 d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

蒙农杂种冰草AcdMYB1基因克隆及表达分析

‘蒙农杂种’冰草(Agropyron cristatum×A.desertorum‘Hycrest-Mengnong’)具有干草产量高，适口性好，抗逆性强的特点，是中国北方干旱地区建立人工草地的适宜草种。本研究利用同源克隆方法从‘蒙农杂种’冰草中克隆得到的1个MYB类转录因子基因(命名为AcdMYB1),对其进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明：该基因cDNA序列长度为1 161 bp,包含完整开放阅读框(ORF)为969 bp,编码322个氨基酸，具有MYB转录因子的保守结构域。AcdMYB1与小麦族的山羊草、普通小麦、野生二粒小麦的同类基因亲缘关系最近，序列一致性均在90%以上。组织表达中AcdMYB1基因在穗中的表达量最高，其次为叶、根，茎中表达量最低；在模拟自然干旱胁迫下，能够显著降低AcdMYB1的表达水平。烟草亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞核。本研究为进一步探索‘蒙农杂种’冰草AcdMYB1基因及MYB转录因子家族提供了科学依据。     

蒺藜苜蓿MtCKX基因功能的初步鉴定

采用RT-PCR法克隆了蒺藜苜蓿MtCKX基因,基因编码区长1635bp,编码544个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码的蛋白与其他物种CKX蛋白具有较高的同源性,与鹰嘴豆的同源性最高。荧光定量分析结果表明,MtCKX基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达量最高。此外,MtCKX基因还响应IAA、6-BA的诱导。成功构建了35S::MtCKX:YFP植物表达载体,亚细胞定位分析表明,MtCKX定位于细胞膜和细胞核。过表达的蒺藜苜蓿MtCKX基因可导致转基因拟南芥中细胞分裂素含量显著降低。     

多年生黑麦草LpPIL5基因特征分析及转录调控

光敏色素互作因子(PIFs)属于bHLH家族的一个亚家族,在植物光信号、激素信号传导和调控植物耐逆性等方面发挥重要作用。本研究从多年生黑麦草中克隆出一个PIF基因,其与拟南芥AtPIF5的亲缘关系最近,因此命名为LpPIL5-like(LpPIL5)。LpPIL5基因编码区序列(CDS)全长为1410 bp,具有5个外显子,编码470个氨基酸,具有典型的bHLH结构域和APB功能域,且其蛋白定位于细胞核。LpPIL5的启动子区域(1500 bp)具有ABRE、MBS和G-box等多种光、激素和逆境响应顺式作用元件。表达模式分析结果显示LpPIL5在叶片中表达量较高,而在根、茎、叶鞘等部位表达量较低。LpPIL5基因的表达受昼夜节律调控,且在光下的表达量显著高于黑暗。此外,聚乙二醇(PEG)、NaCl、CdCl₂和高温逆境及6-苄基腺嘌呤(6-BA)和脱落酸(ABA)等激素处理显著抑制了叶片中LpPIL5基因表达,而在根中,LpPIL5基因的相对表达量在处理的12 h后明显增加,处理24 h时,显著高于对照。     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1个1674bp的开放阅读框,编码557个AA,编码蛋白属于IIb类WRKY家族成员,含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T0代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T1代转基因株系进行抗盐分析发现,在200mmol·L-1 NaCl处理14d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

桑树转录因子CBF1基因的克隆及序列特征与低温应激表达

CBF(C-repeat binding factor)是一类与植物抗逆应答相关的转录因子。利用RT-PCR和RACE技术克隆桑树CBF1基因的全长cDNA序列,命名为MCBF1(GenBank登录号:JX186750)。该基因序列全长1 134 bp,包括693 bp的开放阅读框,87bp的5'端非翻译区和354 bp的3'端非翻译区;预测其编码的氨基酸序列具有保守的AP2结构域,且该结构域的两端拥有CBF家族特有的短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR,与其它植物CBF1的序列相似性较高;基于CBF1序列的系统进化树显示桑树与柑橘(Citrus jambhiri)、垂枝桦(Betula pendula)和切花月季(Rosa hybrid cultivar)的亲缘关系较近。将构建的pET28a-MCBF1原核表达载体转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MCBF1重组蛋白分子质量大小与预测值一致。半定量RT-PCR分析MCBF1基因在未经过低温处理的对照桑苗幼叶中无表达,而在低温处理后的桑苗幼叶中有表达,其中低温处理4 d后的表达量最高。克隆的MCBF1基因编码蛋白质具有典型的CBF家族结构域,并具有低温诱导表达的特点,推测其在桑树对低温的耐受性中发挥作用。     

日本结缕草ZjPPH2基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

利用RACE技术从日本结缕草中克隆得到1个脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶基因ZjPPH2(GenBank登录号:MG870086)。其开放阅读框为1140bp,编码379个氨基酸。构建系统进化树发现,ZjPPH2蛋白与高粱亲缘关系最近。通过染色体步移的方法得到ZjPPH2基因ATG上游1699bp序列,PLACE在线预测结果表明,其启动子序列上具有响应ABA、MeJA、SA的调控元件及若干光响应元件。亚细胞定位结果显示,ZjPPH2定位于叶绿体。荧光定量数据表明,ZjPPH2基因在衰老叶片中的表达量最高,且受ABA、MeJA、SA及黑暗处理的调控。     

乌苏里貉TLR8基因的分子克隆、序列分析及组织表达分析

为了解乌苏里貉TLR8基因特点及其在不同组织中的表达水平,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆其c DNA全长序列,应用生物学软件分析该基因及预测其编码蛋白的特征,并对该基因在乌苏里貉不同组织中的表达水平进行检测。结果显示该基因全长3 191 bp,ORF全长3 117 bp,编码1 038 aa,含有Toll-like受体家族典型的结构域特征。同源性分析显示乌苏里貉TLR8基因核苷酸序列与犬同源性最高,达99.3%,与其他食肉目哺乳动物也具有较高的同源性,在89.2%~92.9%。组织表达分析显示TLR8基因在乌苏里貉各组织中广泛表达但表达量存在差异。本研究结果为进一步研究乌苏里貉抗病毒免疫及育种相关研究奠定了基础。     

野生大豆DREB基因cDNA的克隆与分析

以野生大豆Glycine soja叶片总RNA为模板，根据其他双子叶植物DREBP/AP2结构域的保守氨基酸序列设计简并引物，通过降落和巢式PCR进行扩增，获得1条190 bp的cDNA片段。以此序列设计引物，采用RACE扩增3’和5’末端未知序列，最终克隆到野生大豆DREB全长基因（GsDREB）。该基因1 191 bp编码395个氨基酸，基因内部没有内含子。氨基酸分析表明，其N 末端具有核定位信号（nuclear localization signal, NLS），并具有由58个氨基酸编码的、能够与DNA结合的保守区域 DREBP/AP2结构域。通过多序列比对分析，该基因与拟南芥Arabidopsis thaliana DREB2C氨基酸序列相似性最高，推测其为DREB2亚家族的成员。     

白三叶CHS基因的过表达提高烟草类黄酮的含量

为探索白三叶(Trifolium repens)查尔酮合成酶基因对类黄酮含量的影响,根据NCBI上提供的TrCHS基因(Genbank:2247906)序列,采用RT-PCR方法克隆获得白三叶查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因全长cDNA片段,命名为TrCHS;成功构建含有TrCHS的植物表达载体,在烟草(Nicotiana)中进行遗传转化,经抗性筛选与分子检测,获得了转基因烟草株系,并对其类黄酮含量进行了测定。结果表明,与野生型相比,转基因烟草植株TrCHS表达量和类黄酮含量均显著提高(P<0.05),表明过表达TrCHS可提高烟草类黄酮的含量,这为后续解析TrCHS功能以及白三叶新品种选育提供了可靠的理论依据。     

白羊草NAC转录因子基因的克隆及表达分析

NAC转录因子是植物特有的转录因子并在植物的生长发育过程中发挥重要的作用,根据其他植物NAC转录因子基因的氨基酸保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE技术从白羊草(Bothriochloa ischaemum)中获得了全长cDNA,命名为BiNAC.序列分析表明,该cDNA片段全长为1549 bp,开放阅读框1125 bp,编码374个氨基酸,具有典型的NAC类蛋白的结构特征.进化树分析表明,该蛋白属于ATAF亚族,与高粱(Sorghum bi-color)亲缘关系最近,同源性达到94％.Real-time PCR检测结果表明,BiNAC基因在茎中的表达量最高,根中表达量最少,并且受NaC1胁迫表达上调.同时成功构建了植物表达载体pBI121-BiNAC-GUS,为进一步开展NAC基因的功能研究创造了条件.     

桑树橡胶延伸因子基因的克隆与表达分析

桑树乳汁在桑树的生长和防御过程中起重要作用,乳汁中的糖苷酶抑制剂还是治疗糖尿病的有效成分。通过桑树cDNA文库中的序列比对,发现一段与乳汁合成相关的基因片段,采用RACE方法获得该基因的全长序列,基因cDNA全长1 145 bp,编码区759 bp,编码252个氨基酸残基,将该基因命名为桑树橡胶延伸因子基因(GenBank登录号:GQ466080)。为探究该基因的功能,通过RT-PCR的方法分析该基因在桑树不同组织器官的表达,结果表明该基因在桑树幼叶中的表达量最高,其次是茎和芽,在根中的表达量最低。对桑树叶片进行细胞分裂素处理,发现细胞分裂素处理后该基因表达量有减少的趋势,在细胞分裂素处理的叶片中,正在伸展的幼叶中该基因的表达量要高于刚出现的幼叶和成熟叶。与桑树中已知的其它功能基因相比,桑树橡胶延伸因子在桑树正常生长中的表达量远高于桑树Na+/H+逆向转运蛋白基因MaNHX和桑树抗冻蛋白基因WAP27的表达量。从以上结果初步推测桑树橡胶延伸因子基因在桑树的生长发育中起重要作用。     

草地早熟禾叶绿素酶1基因PpCHL1的克隆和表达分析

利用RACE技术首次从草地早熟禾中克隆出叶绿素酶1基因(PpCHL1)的全长cDNA序列,提交到GenBank,登录号为KU145126;其开放阅读框为951bp,编码361个氨基酸,等电点6.11,平均亲水指数0.084,属于疏水性酸性蛋白。高级结构分析表明,其具有脂肪酶家族的保守域及水解酶特异的功能活性位点。利用实时荧光定量PCR分析其在草地早熟禾根、茎和叶及三种植物生长调节剂脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的表达情况,结果显示PpCHL1基因在草地早熟禾不同组织的表达情况存在明显的组织差异性,叶中的表达量最高且受ABA、SA和MeJA诱导。     

紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因的克隆与逆境下的表达分析

紫花苜蓿是目前全国乃至世界上种植最多的牧草,在畜牧业生产中发挥着重要的作用。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径中一种重要的合成酶,催化γ-生育酚向α-生育酚的转化,改变维生素E组成,利于动物和人体的吸收。本实验通过RACE-PCR技术,得到紫花苜蓿γ-TMT基因的全长cDNA序列,命名为MsTMT。测序和生物信息学分析表明,此序列全长1 306 bp,包含1个长为939 bp的完整开放阅读框(ORF),编码312个氨基酸。MsTMT属于甲基转移酶家族(AdoMet-MTases),有1个腺苷脱氨基酶信号(SLSTDDP),包含有2个保守的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(XXDXGCGIG,VXXPGGXXIX)。Real-time PCR检测结果表明MsTMT基因在紫花苜蓿各组织中均有表达,叶片中表达量最高。受NaCl、PEG以及黑暗诱导后,该基因表达上调;低温胁迫后该基因表达下降;外源ABA不影响该基因的表达。     

桑树光合系统Ⅰ psaE基因的克隆及表达分析

利用桑树(MorusL.)表达序列标签(EST),采用RT-PCR方法克隆了桑树光合系统Ⅰ(PSⅠ)psaE基因的全长cDNA序列,命名为MpsaE(GenBank登录号:GU645972)。序列分析表明,该基因序列全长705bp,存在97bp的5′端非翻译区和170bp的3′端非翻译区,其开放阅读框(ORF)长438bp,编码含有146个氨基酸的蛋白,预测蛋白分子质量为15.38kD,等电点为8.08。同源性分析表明,MpsaE编码蛋白与柑桔(Citrus sinensis)、毛果杨甙(Populus trichocarpa)和欧美杨(Populus eu-ramericana)psaE基因编码的蛋白具有较高的同源性,相似性达到98%。基于MpsaE与其它18个物种的psaE基因编码氨基酸序列构建的系统进化树显示,桑树与柑桔、蓖麻(Ricinus)、毛果杨甙和欧美杨的亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MpsaE基因mRNA在桑树不同组织及部位的转录水平有明显差异:在叶片中的转录水平较高,其中幼叶(刚展开的第1片叶)和中部叶片(8-10位叶)的转录水平最高,其次为上部叶片(2-3位叶)、顶芽和下部叶片;在根部的转录水平最低。初步推测MpsaE基因是桑树PSⅠ参与某些光合生理反应的一个亚基。     

紫花苜蓿MsMYB58基因克隆及抗旱功能鉴定

干旱是限制紫花苜蓿(Medicago sativa)生长的重要环境限制因子，MYB转录因子广泛参与调控植物的生长发育和非生物胁迫。本研究对紫花苜蓿MsMYB58基因进行克隆及生物信息学分析，初步解析紫花苜蓿MsMYB58在干旱胁迫应答过程中的功能。结果显示，MsMYB58开放阅读框全长1 002 bp,编码蛋白含有333个氨基酸，分子量为37.80 kDa,属于典型的R2R3-MYB家族成员，定位在细胞核、细胞壁和细胞膜中。MsMYB58的组织特异性表达主要在茎中，在根中的表达最少；在脱落酸、盐和自然干旱处理中，MsMYB58的表达水平呈现不同的变化趋势。干旱胁迫下，过表达MsMYB58的转基因烟草的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性和脯氨酸含量显著增加，而丙二醛的含量则显著下降，叶绿素荧光参数PSⅡ利用效率和PSⅡ最大光化学量子产量显著升高，非光化学猝灭显著下降。本研究初步探究了紫花苜蓿MsMYB58在干旱胁迫应答过程中的功能，为进一步挖掘紫花苜蓿干旱响应功能基因提供理论基础。