羊草△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(LcP5CS1)基因的克隆与分析

羊草具有耐寒、耐盐和耐早等特点,是一种兼具经济价值和生态价值的多年生重要牧草.脯氨酸是植物在渗透胁迫下积累的主要渗透调节物质之一.△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶.根据前期Solexa测序结果的数据,设计同源引物,从羊草中克隆了一个P5CS基因,该基因cDNA序列全长2 197 bp,推断其编码730个氨基酸,根据序列比对将其蛋白命名为LcP5CS1.同源性分析表明:LcP5CS1与单子叶植物短柄草P5CS的同源性为95％,而与双子叶植物的P5CS同源性较低.表达模式分析表明,在叶鞘、叶和茎中,LcP5CS1均有较高表达;在冷、ABA、盐和干旱胁迫下,该基因明显受胁迫诱导,并随胁迫时间的延长,其表达量总体呈上调趋势.对羊草人工创伤处理后的Solexa测序差异表达数据分析表明:LcP5CS1在处理2和6h后表达量明显提高,推测羊草创伤处理后体内脯氨酸含量升高可能是其耐牧的一种适应性机制.     

3份高羊茅材料吡咯琳-5-羧酸合成酶基因的结构及酶活性比较

吡咯琳 5 羧酸合成酶（Pyrroline 5 Carboxylate Synthetase,P5CS）是经谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶,脯氨酸的积累有助于提高植物的抗逆性。本研究以黔草一号高羊茅（Festuca arundinacea cv.Qiancao No.1,QC1）、黔草二号细叶高羊茅（F.arundinacea cv.Qiancao No.2n,QC2n）和黔草二号宽叶高羊茅（F.arundinacea cv.Qiancao No.2b,QC2b）为材料,经RT PCR克隆得到P5CS基因,基因长2 151 bp,含有完整的开放读码框（Open Reading Frame,ORF）,编码716个氨基酸,与朝鲜碱茅（Puccinellia chinampoensis）P5CS基因的相似性为94%。对3份高羊茅材料P5CS基因编码的氨基酸序列进行比较,有6个氨基酸差异,这些氨基酸均处于P5CS蛋白的谷氨酸激酶（Glu 5 Kinase,G5K）功能区,其中第37、85及142位的氨基酸所带电荷发生了改变。比较干旱处理后3份高羊茅材料叶片的P5CS酶活性及其脯氨酸含量,QC1叶片的P5CS酶活性及其脯氨酸含量最高,其次为QC2n,QC2b最低。说明P5CS中谷氨酸激酶（G5K）功能区重要氨基酸种类的改变,可能影响高羊茅P5CS的酶活性及其脯氨酸的生成量,也是高羊茅抗逆性差异的主要原因。     

不同类型抗盐植物整株水平游离脯氨酸的分配

采用田间试验及盆栽试验,对3种不同类型(拒盐、泌盐和稀盐)的抗盐植物植株水平游离脯氨酸的分配特性进行了研究。结果表明,不同类型的植物游离脯氨酸有如下的规律:稀盐植物整株中的游离脯氨酸的含量很低;泌盐植物整株中的游离脯氨酸的含量介于稀盐植物和拒盐植物之间;拒盐植物整株中的游离脯氨酸含量明显高于前2类植物。3种类型的抗盐植物植株中游离脯氨酸分配的共同特点是游离脯氨酸多集中于代谢旺盛的光合器官和生殖器官,在盐逆境下植物优先保护其光合器官和生殖器官。     

不同环境梯度上群落优势种脯氨酸含量的变化

植物在逆境胁迫条件下,脯氨酸在体内大量积累,是反映植物抗胁迫性的重要生理指标。文章采用茚三酮比色法对放牧退化梯度(轻、中、重)和恢复梯度(围栏内、外)两种环境梯度下草原群落主要优势种脯氨酸含量进行测定分析,研究发现:随着放牧强度的增加,群落种类组成发生明显变化,植物在群落中的优势地位也逐渐由葱属植物代替禾本科植物,优质牧草的植物数量及所占比例减少,而退化指示植物种显著增加。在退化梯度上和短期恢复梯度上,植物地上部分脯氨酸含量均高于地下,脯氨酸的积累与植物抗旱敏感度密切相关。     

冰草组织培养再生体系建立及耐旱转基因研究

本研究以冰草属植物中的4个品种——蒙古冰草新品系(A.mongolicum Keng)、航道冰草(A.cristatum cv.Fairway)、诺丹冰草(A.desertorum cv.Nordan)和一个种间杂种冰草——蒙农杂种冰草(A.cristatum×A.desertorum cv.Hycrest-Mengnong)为材料,分别以幼穗为外植体建立了冰草组织培养再生体系。在此基础上,以调控脯氨酸生物合成最后一步的关键酶的突变体基因P5CS为目标基因,bar基因为筛选标记基因,用基因枪法轰击幼穗诱导的愈伤组织,获得转基因植株。利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中分离得到了CBF4及其启动子,并对CBF4启动子进行了序列分析和初步的功能分析。     

大蒜芥Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(P5CS)的克隆及表达分析

Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物渗透胁迫下脯氨酸合成谷氨酸的关键酶。利用RACE结合RT-PCR技术克隆获得大蒜芥(Sisybrium altissimum)SaP5CS1基因全长cDNA序列,该基因全长1 907bp,其中开放阅读框为1 719bp,编码573个氨基酸,预测编码蛋白质的等电点为4.95,分子量为156.279kDa。同源分析显示,SaP5CS1与甘蓝型油菜(Brassica napus)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的蛋白序列相似性分别为98%和96%。实时荧光定量PCR分析表明,在干旱逆境胁迫条件下,大蒜芥SaP5CS1基因在根和叶的相对表达量受胁迫的诱导均上调。SaP5CS1基因的克隆及序列分析将为其功能分析和分子育种奠定基础。     

转基因冰草植株耐盐性研究

以转P5CSF129A基因的冰草属(Agropyron Gaertn)阳性植株(97#、19#、66#)和阴性植株为材料,测定叶片脯氨酸含量、相对含水量、质膜透性和K⁺/Na⁺比值4项耐盐指标。结果表明:转基因植株的脯氨酸含量明显高于阴性植株,说明P5CSF129A基因已经在冰草转化植株体内表达,提高了转基因植株的耐盐性;其它耐盐指标的结果也证明转基因冰草植株的耐盐性高于对照植株。对转基因植株和阴性植株的耐盐能力综合评定结果是97#>19#>66#>阴性植株。     

在放牧干扰下冷蒿种群脯氨酸含量的变化

对放牧干扰下土壤含水量、冷蒿体内含水量、脯氨酸含量变化进行的研究结果表明随着放牧强度的增加土壤含水量降低,冷蒿叶片、根中含水量呈下降趋势。在生长初期,随着放牧强度的增加冷蒿叶片内脯氨酸含量迅速积累;生长盛期脯氨酸含量虽随牧压有所增加,但增加的幅度较小;生长末期脯氨酸含量较高,而且随着牧压的增加略有下降。地下部分,脯氨酸含量在牧压梯度间变化较小。相关分析表明,在生长初期和盛期,冷蒿叶片、根的含水量与土壤含水量呈正相关,生长末期不相关。冷蒿脯氨酸含量与植物的含水量呈负相关,在生长初期和末期呈显著负相关,而生长盛期相关不显著;与此不同,在生长初期冷蒿体内脯氨酸含量与土壤含水量呈负相关,在生长末期二者负相关性不显著,这说明随着放牧干扰强度的增加土壤含水量降低,导致冷蒿体内水分胁迫增加,致使脯氨酸开始逐渐积累。而生长末期的降温和群落中植物种间竞争减少,使脯氨酸的积累速度也相应放慢。在放牧干扰下,脯氨酸大量积累,对冷蒿的生存和生长起到了重要的作用,是冷蒿种群耐啃食、耐践踏、逐渐取代禾本科植物而成为退化草原的优势植物的生理基础之一。     

6种植物在逆境胁迫下脯氨酸的累积特点研究

以甘南亚高山草甸植物为研究样本,分析了不同环境梯度条件下的6种植物:莓叶委陵菜Potentilla fragarioides、火绒草Leontopodium leontopodioides、矮嵩草Kobresia humilis、棘豆Oxytropis kansuensis、狼毒Stellera chamaejasme、金露梅Potentilla fruticosa的游离脯氨酸的积累与变化。结果表明:随着生境(包括土壤水分、光照、温度等)的变化,6种植被叶片内脯氨酸含量随着从阴坡、半阴半阳坡、阳坡环境的变化都有不同程度的增加;而且,植物品种的不同,脯氨酸含量的增加幅度有差异,进一步可以认为叶片内脯氨酸含量的高低可作为衡量植物抗逆性的指标。     

兰州市4种常见园林观花地被植物抗旱性比较研究

以兰州市4种常见园林观花地被植物为研究对象,通过采用人工模拟不同土壤水分胁迫,分组测定各参试植物的株高、叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量等指标, 并用隶属函数法对其抗旱性进行综合评价。结果表明:随着干旱胁迫的加剧,植物的株高、叶绿素含量与对照相比呈不同程度的下降趋势,金盏菊(Calendula officinalis)株高降幅最大,叶绿素含量万寿菊(Tagetes erecta)下降高于其他植物;叶片脯氨酸和丙二醛的含量随干旱程度的增加而升高,万寿菊脯氨酸含量增幅较大,丙二醛含量金盏菊增幅较大;4种地被植物的抗旱性强弱顺序依次为金盏菊> 矮牵牛(Petunia hybrida)> 一串红(Salvia splendens)> 万寿菊。研究表明,植物的株高、脯氨酸含量、丙二醛含量与其实际抗旱性密切相关,可作为评价园林地被植物抗旱性的有效指标。     

盐胁迫对菊苣幼苗脯氨酸积累及其代谢途径的影响

以菊苣(Cichorium intybus L.)为材料,研究不同浓度NaCl处理对菊苣幼苗体内脯氨酸代谢的影响,以期揭示菊苣中脯氨酸代谢的基本规律。结果表明:随着处理浓度的增加,菊苣中鸟氨酸δ-氨基转移酶(δ-OAT)活性呈上升趋势;吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性呈现先升后降的趋势;脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性呈下降趋势;而脯氨酸含量则显著上升(P<0.05),但高浓度长时间处理后略有降低。研究表明,NaCl胁迫下谷氨酸(Glu)途径和鸟氨酸(Orn)途径对菊苣中脯氨酸的积累均有贡献,低浓度胁迫时P5CS起关键作用的Glu途径占主导地位,高浓度胁迫时δ-OAT起关键作用的Orn途径占主导地位。     

NaCl胁迫对苦马豆苗期脯氨酸代谢的影响

以苦马豆(Swainsonia salsula Taub.)为试验材料,通过8个不同浓度(0(CK),80,160,240,320,400,480和560 mmol·L^-1 )NaCl胁迫,对苦马豆苗期脯氨酸(Pro)含量及吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)、鸟氨酸δ-氨基转移酶(δ-OAT)和脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性进行测定,探讨苦马豆对NaCl胁迫的耐受程度和脯氨酸代谢与其耐盐性的关系,以期揭示苦马豆苗期脯氨酸代谢规律,为进一步研究其耐盐性奠定基础。结果表明:在NaCl胁迫下,苦马豆植株根冠比呈现先升高后降低的趋势,苦马豆中脯氨酸含量随NaCl浓度的升高而增大(P＜0.05),在400 mmol·L^-1 NaCl胁迫时,脯氨酸代谢最为旺盛;400 mmol·L^-1 NaCl浓度为苦马豆耐盐阈值。随NaCl浓度的不断升高,苦马豆苗期脯氨酸合成由以鸟氨酸途径为主逐渐转变为以谷氨酸途径为主,鸟氨酸途径为辅的协同合成。     

干旱对桑树质膜透性脯氨酸积累的影响

在土壤干旱条件下,测定了桑叶质膜透性、游离脯氨酸含量。结果表明,桑叶质膜透性和游离脯氨酸的含量随着干旱程度的加剧而增加。且游离脯氨酸增加的幅度比质膜透性大;不同叶位的桑叶,虽然都表现出增加,但质膜透性随叶位数由上往下的递增而增加,游离脯氨酸含量则减少;桑树对干旱的反应存在着品种间的差异,在同样的旱境中,质膜透性能较好地反映桑树抗旱性强弱,可作为鉴别桑树抗旱性的指标之一,游离脯氨酸的变化与桑树抗早性的关系不很一致,但其增加的速率,可作为桑树受旱而发生变化的敏感参数。     

盐胁迫对碱地风毛菊苗期脯氨酸代谢的影响

通过对碱地风毛菊(Saussurea runcinata)苗期分别以NaCl和Na₂SO₄进行胁迫,设6个浓度和1个对照,测定其脯氨酸含量及δ-氨基转移酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶和脯氨酸脱氢酶活性,以探讨其苗期耐盐性及脯氨酸代谢途径,并为盐碱地植被恢复与改良提供依据。结果表明:NaCl和Na₂SO₄胁迫下,碱地风毛菊的脯氨酸含量随NaCl和Na₂SO₄胁迫浓度增加而增高,在盐胁迫下,碱地风毛菊的脯氨酸合成途径以鸟氨酸途径为主;且在300mmol·L^-1的盐浓度胁迫下碱地风毛菊苗期的脯氨酸代谢最为旺盛,其对NaCl胁迫的耐性较高。     

晚秋刈割对不同秋眠类型苜蓿根系游离脯氨酸含量的影响

对三种不同秋眠类型9个苜蓿品种进行晚秋的最后1次刈割试验，研究不同刈割时间对苜蓿根系游离脯氨酸含量的影响。结果表明，在不同日期刈割的不同秋眠类型的苜蓿，其根系游离脯氨酸含量一直呈上升趋势，在11月20日达到峰值，但在此时不同秋眠类型苜蓿根系游离脯氨酸含量没有显著差别，此后游离脯氨酸含量开始下降，到翌年苜蓿开始返青时再次上升，低秋眠类型苜蓿根系游离脯氨酸含量显著地高于高秋眠类型苜蓿。     

紫花苜蓿的抗寒生理适应性研究

通过对3个紫花苜蓿Medicago sativa品种根部可溶性糖、全氮、丙二醛（MDA）、游离脯氨酸和游离氨基酸含量动态变化进行分析,研究它们与苜蓿抗寒性之间的关系。结果表明,苜蓿根内可溶性糖、全氮、游离脯氨酸和游离氨基酸含量会在秋冬季升高,并在整个冬季保持较高水平,春季返青时下降,苜蓿根内MDA含量在秋季升高,并随晚秋气温进一步下降而降低。此外,各紫花苜蓿品种综合测定的参数说明,阿尔冈金抗寒性最强,金皇后次之,甘农3号最差。