猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株ORF3基因的原核表达

通过 PCR方法从重组质粒 p GEM- ORF3扩增得到缺失 N端疏水序列的基因片段 d ORF3(deleting ORF3)。将d ORF3克隆至原核高效表达载体 p GEX- 4 T- 2 ,在 E.coli BL 2 1细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组蛋白GST- d ORF3,表达产物以包涵体的形式存在 ,表达量为 30 .6 % ,Western- Blot结果表明重组蛋白可被 PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究 PRRS病毒次要结构蛋白 GP3的免疫特性和功能奠定了基础     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州爿离株ORF5基因原核表达的研究

通过对PRRSV贵州分离株（Guizhou-1）RNA的提取和RT-PCR方法扩增得到ORF5基因,成功构建原核表达载体pET-32a—ORF5,转化至宿主菌BL21（DE3）中,诱导蛋白表达,并对诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析,得到了约42．9ku左右的表达蛋白,与预期大小相...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州爿离株ORF5基因原核表达的研究

通过对PRRSV贵州分离株（Guizhou-1）RNA的提取和RT-PCR方法扩增得到ORF5基因,成功构建原核表达载体pET-32a—ORF5,转化至宿主菌BL21（DE3）中,诱导蛋白表达,并对诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析,得到了约42．9ku左右的表达蛋白,与预期大小相符,表明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在大肠杆菌中能表达,并具有一定的生物学活性。动物免疫试验表明纯化蛋白和包涵体均可刺激小鼠产生抗体,纯化蛋白的效果优于包涵体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达

本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF7基因序列进行分析。结果表明,ORF7基因的原核表达载体构建成功。ORF7基因序列与美洲型的ORF7基因核苷酸同源性为92.8%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为65.3%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为92.0%～99.2%,与LV株的同源性为65.3%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。本研究为N蛋白的进一步研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征RT-PCR诊断及ORF5基因原核表达载体的构建

参照GanBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒核苷酸序列,利用生物软件,设计1对ORF5基因的特异性引物,用Trizol法提取病料的总RNA,进行RT-PcR扩增后获得目的基因,将其连接到PMD18-T载体后转入大肠杆菌Top10细胞中,抽提质粒并双酶切,回收目的基因,然后克隆于原核表达载体PET-32a(+)中,通过抗性筛选、酶切鉴定和序列测定,证实得到含有目的基因的阳性克隆,本实验成功构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因原核表达载体PET-ORF5,为进一步研究ORF5基因的原核表达及猪繁殖与呼吸综合征的基因工程疫苗的研究奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达

根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV GD)的序列,设计一对引物。用保存的PRRSV GD 的ORF5 的克隆产物pMD ORF5 质粒作为模板,扩增ORF5基因。将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达。用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3(cz)株ORF5基因序列分析及原核表达

从河北沧州分离到1株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过4代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株.根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株ORF5基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF5基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一对引物(P3/P4)从重组载体pGM-ORF5中扩增出缺失了N 端28个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,并成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应.为研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及ORF5基因的序列分析

采集菏泽地区某猪场PRRS疑似病料,在Marc-145细胞上进行病毒分离,得到一株病毒HZ0622,通过免疫荧光试验初步鉴定分离病毒为PRRSV。对ORF5基因进行克隆和测序,并利用DNAStar软件将测定序列与国内外代表性毒株进行同源性比较,结果表明：分离株HZ0622 ORF5基因与美洲型代表毒株VR-2332的同源性为89.55%,与LV株同源性为61.17%,与中国高致病性PRRSV毒株JXA1、HEB1、SY0608、SD-4的同源性分别为98.84%、98.34%、99.00%、99.34%;进化树分析结果表明,分离株HZ0622和高致病性PRRSV在同一进化分支,且与2007年分离的SD-4有更近的亲缘关系。HZ0622分离株属于美洲型毒株,可能属于高致病性PRRSV。     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。     

抗体免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3和 ORF5基因变异研究

本试验旨在对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在抗体免疫选择压力下分子变异情况进行研究。将HPPRRSV-JXA1株在添加适量抗体或不添加抗体的Marc-145细胞上连续传代各30代,获得毒株JXA1-Abf30和JXA1-f30。对传代前后毒株的ORF3和ORF5基因进行扩增、克隆和序列分析,研究结果显示,JXA1-Abf30和JXA1-f30在ORF3和ORF5基因上核苷酸发生突变位点数累计分别为18和9个,氨基酸发生突变位点数累计分别为15和3个。JXA1-Abf30和JXA1-f30的核苷酸突变速率比为186%,氨基酸突变速率比为500%,非同义突变(NS)与同义突变(S)比值(NS/S)分别为5.0和0.5。此外,抗体压力下传代的毒株ORF5基因有4个碱基位点发生稳定的非同义突变,其中2个(AA31和AA190)与已知抗原表位有关。由研究结果可知,抗体压力下传代的PRRSV的突变速率和非同义突变数目明显高于无抗体压力下的传代毒株;抗体免疫选择压能显著影响PRRSV的ORF5基因变异,并呈现明显的压力选择性突变,对ORF3基因变异的影响小于ORF5基因。     

修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因DNA疫苗的免疫效力，将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5的中和表位和覆盖表位间，获得修饰后的ORF5基因ORF5M。在此基础上，进一步构建了ORF5M的真核表达质粒pCl-52M。间接免疫荧光证实体外表达后，免疫BALB／c小鼠，检测免疫后的ELISA抗体和中和抗体，并与未经修饰的ORF5基因真核表达质粒pCl-52进行比较。结果表明，修饰后的DNA疫苗pCl-52M诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的DNA疫苗pCl-52，是一种具有良好开发前景的PRRS新型疫苗。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

猪繁殖和呼吸综合症山东分离株ORF7基因的克隆、测序及鉴定

山东某些养殖场发生以母猪流产或产死胎、木乃伊等为特症的流行性繁殖障碍病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)所致。自行设计了一对针对PRRSV的N基因的特异性引物P1和P2,通过RT-PCR技术对分别从潍坊和济南收集到的可疑病料进行检测,结果为阳性,并得到1条366bp的DNA片段。纯化此扩增产物,然后与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α。结果得到了1个ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒PMD-18T- ORF7。通过EcoRI/BamHI双酶切及PCR证明此重组质粒即为ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒,从而为ORF7基因及其表达的核表壳蛋白进一步研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南分离株ORF5基因的遗传进化分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在湖南省地方猪保种场的感染情况,本研究在2019－2020年间从湖南省2个地方猪保种场采集287份全血样品。首先将血样混合成41份,采用RT-PCR或PCR法进行PRRSV病原检测,进一步通过高保真PCR扩增从PRRSV阳性样品中扩增PRRSV ORF5基因;测序后利用DNAStar软件分析获得的ORF5基因及其编码的GP5氨基酸与国内外不同PRRSV毒株的遗传进化关系;最后用PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞,经盲传分离毒株,并用Reed-Muench法测定病毒滴度。结果显示,检测的41份混样中有3份PRRSV病原核酸呈阳性;从PRRSV阳性混样中单独扩增获得6条PRRSV ORF5基因序列,均属于PRRSV-2型的lineage 8分支,相似性为99.2%~99.8%;6条ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在信号肽区域（第23位）、潜在的N-糖基化位点（第33位）和表位C （第59位）存在差异;PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞盲传5代后出现明显的细胞病变,获得1株PRRSV毒株,命名为NX-1,病毒TCID₅₀为4×10⁵/mL。本研究表明,湖南省地方猪保种场存在PRRSV感染,感染的PRRSV属于PRRSV-2型的lineage 8,其GP5氨基酸序列存在的多处变异可能是造成疫苗免疫失败的原因之一,以上结果可为湖南省地方猪保种场的免疫防控提供一定参考。