双向电泳检测奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质方法的建立

为研究不同激素或营养素对乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响,本实验建立细胞核磷酸化蛋白质提取方法及双向电泳实验技术。结果表明,细胞核磷酸化蛋白纯化结合双向电泳技术是乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学研究的有效方法,可为进一步研究乳腺上皮细胞机理提供技术基础。     

双向电泳分析蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响

为了寻找奶牛乳腺上皮细胞核中与乳蛋白合成相关的重要蛋白质,从翻译水平揭示乳蛋白合成的机理,本试验应用双向凝胶电泳技术和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的方法,分析添加蛋氨酸后奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的变化,并采用Western blotting验证。质谱分析鉴定出5个表达上调的细胞核磷酸化蛋白质,分别是葡萄球菌核酸域包含蛋白质1、甘氨酰-tRNA合成酶、Septin-6、Twinfilin-1和延长因子1-beta,这些蛋白质的功能涉及DNA转录、mRNA翻译、蛋白质合成、细胞分裂、细胞形态发生及细胞周期的调控。     

奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组双向电泳方法的建立

蛋白质样品的双向电泳分离效果受各种试验条件的影响较大,针对不同来源的蛋白样品进行试验条件的优化可获得具有较高分辨率的双向电泳图谱。试验拟建立优化的奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质双向电泳分离体系,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对关键因素进行优化,采集电泳图谱并分析双向电泳图谱中蛋白斑点的数量、图像分辨率及背景条纹的变化。通过对试验条件的筛选和优化,成功建立了具有较高分辨率的奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组双向电泳分离体系。     

奶牛乳腺上皮细胞系的建立

采用组织块种植法,成功地培养了奶牛乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状的检测,建立并鉴定了正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力。通过对细胞传代及反复冻存,建立了奶牛乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。     

雌激素对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白和甘油三酯表达的影响

为探讨雌激素对乳腺上皮细胞中酪蛋白及甘油三酯表达的影响,试验于2018年2月至2018年4月在新疆肉乳用草食动物营养实验室进行,实验选取扩增生长状态良好的乳腺上皮细胞,添加0、50、100、200μmol/l雌激素孵育乳腺上皮细胞后,分别在12、24、48、72 h后检测各组细胞酪蛋白及甘油三酯表达的情况。结果显示,在12 h时,添加50μmol/l雌激素组CSN1的表达量极显著高于对照组(P<0.01),添加50μmol/l雌激素组TG表达量极显著高于对照组(P<0.01);50μmol/l雌激素添加组CSN1表达量显著高于200μmol/l雌激素添加组(P<0.05),且极显著高于100μmol/l雌激素添加组(P<0.01),100μmol/l雌激素添加组CSN2表达量显著高于200μmol/l雌激素添加组(P<0.05),50μmol/l雌激素添加组TG表达量极显著高于100、200μmol/l雌激素添加组(P<0.01);添加50μmol/l雌激素时,12、48、72 h的CSN1表达量显著高于24 h(P<0.05),在72 hCSN2表达量显著高于其他各时间点(P<0.05),24、72 h时TG表达量显著高于12、48 h(P<0.05)。结果发现,添加雌激素可以促进乳腺上皮细胞中CSN1、CSN2及TG的表达。200μmol/l在一定条件下促进CSN1的表达效果最好;100、200μmol/l雌激素添加组均能够促进CSN2的表达,且100μmol/l促进CSN2的表达效果最好,尤其是在12、24 h;50、200μmol/l雌激素添加组可以促进TG的表达,但100μmol/l雌激素添加组能够抑制TG的表达。     

奶牛乳腺上皮细胞的培养及NOD2定位

为获得纯净的奶牛乳腺上皮细胞并对细胞中的NOD2受体进行定位,本试验采用胶原酶Ⅰ消化法培养奶牛乳腺上皮细胞,通过免疫荧光技术对细胞进行鉴定并对细胞中NOD2进行定位。结果显示:本试验获得了纯净的奶牛乳腺上皮细胞;NOD2受体多表达于奶牛乳腺上皮细胞的细胞核中,且以核仁的表达量最高。     

奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

本试验通过组织块培养法获得了奶牛乳腺上皮细胞,联合运用刮除法、相差消化和相差贴壁法、单克隆法对细胞进行纯化,应用倒置显微镜和β-酪蛋白表达检测了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征和乳蛋白表达,鉴定该细胞为上皮型细胞。     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养研究进展

体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)常被用于研究乳成分的合成调控以及乳腺的生理代谢.近年来,随着越来越多永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立,其应用也更为广泛.本文综述了奶牛乳腺细胞系的种类和奶牛乳腺细胞体外培养的方法,为研究乳腺上皮细胞的功能及泌乳机制提供参考.     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL.经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况.结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态.     

雌激素及其受体对动物乳腺上皮细胞泌乳性能的影响

雌激素是一种在较高等动物和人体内存在的内源性雌性激素,雌激素主要有雌二醇、雌三醇和雌酚等。雌激素对雌性哺乳动物生殖发育及泌乳能力的影响已经成为近年来的研究热点之一。作者对雌激素及其受体对雌性哺乳动物乳腺上皮细胞的作用作一简要综述。     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

雌激素对奶牛乳腺上皮细胞增殖水平的影响

本研究旨在探讨不同浓度的雌二醇(estradiol,E2)对体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响。结果表明:低浓度(0.5、1.0和5.0nmol/L)E2能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖、同时增强SOD活性,减弱LDH活性和MDA含量;但长期处于高浓度(100nmol/L)E2环境下,对乳腺细胞增殖则起抑制作用并引起细胞损伤。     

精氨酸对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响

本研究以奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）为模型,研究添加不同浓度精氨酸对BMECs酪蛋白合成的影响。采用单因素完全随机试验设计,以0.70 mmol/L精氨酸（DMEM培养基中精氨酸的浓度）为对照组,试验组精氨酸的浓度分别为1.40、2.80、5.60和11.20 mmol/L,每组6个重复。采用MTT法检测BMECs的增殖率;利用酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒检测BMECs中精氨酸代谢关键酶活性;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测BMECs中精氨酸代谢关键酶、酪蛋白以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路基因的相对表达量;运用蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术检测酪蛋白表达量及mTOR信号通路蛋白磷酸化水平。结果表明：1）当精氨酸的浓度为2.80 mmol/L时,BMECs的增殖率显著高于对照组和其他精氨酸组（P<0.05）;当精氨酸的浓度为2.80和5.60 mmol/L时,BMECs中鸟氨酸脱羧酶活性显著高于对照组和其他精氨酸组（P<0.05）。2) 2.80 mmol/L精氨酸组BMECs中αs1-酪蛋白、к-酪蛋白、蛋白激酶B、m...     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

奶牛乳腺上皮细胞的克隆与特性分析

用组织块接种法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,进行形态学观察、生长曲线的绘制和核型分析等生物学性状的检测,并进行酪蛋白基因的RT-PCR鉴定。结果显示,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞生长旺盛,具有典型的上皮细胞形态特征;染色体数目为60;能够正常表达奶牛乳腺上皮细胞的2种特异性酪蛋白基因,即as1-酪蛋白基因和β-酪蛋白基因。表明成功获得了奶牛乳腺上皮细胞克隆。     

蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白质组的影响研究

为寻找奶牛乳腺上皮细胞亚细胞结构中与泌乳相关的重要蛋白质、从蛋白质水平揭示乳蛋白合成的调控机制,应用双向凝胶电泳技术分离体外培养的蛋氨酸处理组与正常组奶牛乳腺上皮细胞蛋白质,利用Image Maser 2D软件对图谱进行对比分析,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和数据库检索鉴定,并采用实时荧光定量PCR技术在mRNA水平上验证2-DE结果。质谱鉴定出8个表达上调的差异蛋白质,大多数差异蛋白质的功能涉及细胞骨架构成、能量代谢等过程。这些差异点的发现为研究奶牛泌乳机理提供了有益的线索。     

荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

用外科手术的方法采取健康的泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织,采用机械剪切结合酶消化的方法,在体外进行原代乳腺上皮细胞分离培养。结果成功地培养出荷斯坦奶牛原代乳腺上皮细胞。显微镜下观察,细胞形成单层呈鹅卵石样;角蛋白免疫组化染色后,呈现阳性反应。经数次传代后,细胞增殖依旧旺盛。     

不同方法分离奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究

从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过不同的方法分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果.结果表明:组织块接种、0.25%的胰酶和100 u/mL透明质酸酶的混合液37℃消化组织块3 h.可以得到大量细胞用于原代培养.在以DMEM/F12为基础培养液,在培养液中添加10%的胎牛血清、100μg/mL的双抗、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠等,组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好.上皮细胞显微结构显示:奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中舍有不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈多角形,细胞之间连接成片,细胞界限明显,部分细胞界限不明显.     

体外培养奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察

荷斯坦奶牛是我国饲养的主要奶牛品种。研究荷斯坦奶牛乳腺发育的生理、病理对于奶牛育种和保障奶牛健康均具有重大意义。因此，进行荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞分离培养及形态学研究，可为今后的工作奠定基础。本研究在形态学方面对培养的乳腺上皮细胞进行了系统的阐述，以期对今后的研究提供借鉴。     

必需氨基酸调控奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的研究进展

乳蛋白含量的高低是衡量乳品质的重要指标,奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）是乳腺合成乳蛋白的基本功能单位。必需氨基酸（EAA）作为乳成分前体物质,其不仅是乳蛋白合成的底物,而且可以作为信号分子调控乳蛋白的合成。本文综述了近年关于EAA对BMECs乳蛋白合成的影响及其潜在的信号通路机制的研究进展,为今后系统研究氨基酸对BMECs乳蛋白合成的调控及提高泌乳奶牛氨基酸转化为乳蛋白的效率提供参考。