达氟沙星间接竞争ELISA检测方法的建立

将达氟沙星（danofloxacin, DFLX）与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联分别作为免疫原与包被原, 达氟沙星为竞争的半抗原，建立间接竞争ELISA检测方法。试验结果表明,理想的包被抗原浓度为1.25 μg/L, 多抗(DFLX-PcAb)工作浓度为1∶10000,酶标二抗的工作浓度为1∶4000,最适检测范围为0.1～10 ng/L,最低检测限为0.2 ng/L, 批内和批间变异系数分别为3.81%和6.25%。得到回归方程y=0.7975-0.125x（R2=0.989）和标准曲线，从而建立了DFLX的快速检测残留的间接竞争酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）。     

二氟沙星残留检测用单克隆抗体的制备及其鉴定

用DFX-BSA免疫BALB/c小鼠,采用显微克隆技术成功筛选出5株特异性分泌细胞株1a6、2b4、4a4、X1和X2。将X1株细胞株直接注入小鼠腹腔获取腹水,腹水纯化后效价达1:1638400。蛋白质含量为6.86mg/ml,单抗X1属IgG2a亚型。X1株单克隆抗体的检测标准曲线方程为Y=0.4813-3.1067X(R=0.9510),最低检测限(LOD)为2ng/ml,线性范围为0.002-5μg/ml,DFX对其IC50为0.085μg/ml。单抗对氟喹诺酮类药物有一定的交叉反应,对沙拉沙星最高可达10.9%,对兽医临床常用抗菌药物氨苄西林、卡那霉素、盐酸四环素、磺胺甲噁唑和氯霉素等没有交叉反应。Ci-ELISA反应中McAb对低浓度的乙腈和丙酮具有良好的耐受性,而低浓度的甲醇对McAb的结合力有一定的影响。     

建立水产品中己烯雌酚残留ELISA检测方法

本试验利用己烯雌酚(DES)单克隆抗体,通过优化反应条件,加标回收试验,确定ELISA检测方法相关参数,建立了己烯雌酚残留的酶联免疫吸附(ELISA)检测法。试验结果显示,包被抗原最佳浓度为2μg/mL,DES单克隆抗体最佳稀释倍数为1∶3×104;标准曲线呈线性相关,相关系数R2=0.9956,IC50=1.103 ng/mL,最适检测范围为0.125~128 ng/mL,检测敏感度为0.077 ng/g;批内和批间变异分别为6.14%和7.48%;鳝鱼肌肉组织的加标回收率为77.6%~94.6%;特异性试验结果表明,该单抗与己烯雌酚单羧丙基醚交叉反应率为112.7%,与其它水产禁用药物交叉反应率0.1%。     

生猪盐酸克伦特罗残留检测报告

盐酸克伦特罗(clenbuterol),为一种肾上腺素β-激动剂,被广泛用作支气管舒张,用于治疗动物和人的阻塞性支气管哮喘。盐酸克伦特罗还有较强的促肌肉蛋白合成作用和促脂解作用,长期给予高剂量的盐酸克伦特罗会增加体内蛋白质积累,减少脂肪储存。促进动物肌肉生长。用它喂养生猪．可提高瘦肉率,但人食用含盐酸克伦特罗过量的肉制品,会出现心率过速、心悸、肌肉震颤等心血管系统和神经系统的不良反应,严重危害人体健康。农业部、对外贸易经济合作部和国家出入境检验检疫局等部门多次发文,严令禁止在动物生产中使用盐酸克伦特罗。     

氯霉素残留检测方法

1 氯霉素的残留检测方法 氯霉素残留检测方法的建立始于20世纪70年代,到现在为止,国内外已相继建立起了气相色谱、液相色谱、薄层色谱、放射性分析、微生物法及免疫学检测等方法。最为灵敏的气相色谱检测方法是Jacabson等（1974）提出的。德国Russel首先报道了液相色谱法检测氯霉素的残留。Arnold和Somogyl建立了放射免疫分析试验方法,Camphell等建立了酶联免疫吸附测定法。     

农畜产品中三聚氰胺间接竞争ELISA检测方法的建立

利用制备的抗三聚氰胺单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法,采用棋盘滴定法确定最佳三聚氰胺-OVA包被浓度为1.0 μg/mL,单抗最佳稀释度为1∶1 000,最佳的封闭液为50 g/L的脱脂乳,标准曲线的线性方程为y=-15.12x+107.3(R2=0.997).批内变异系数(CV)为1.07％～5.53％,批间CV值为3.33％～11.92％,确定此方法精确度良好.利用建立的间接竞争ELISA方法,测定添加有三聚氰胺标准溶液的样品(宠物食品、小麦面筋、饲料、牛乳、鸡蛋),得到三聚氰胺在各样品中的回收率范围分别为宠物食品73.8％～84.32％,小麦面筋67.3％～88.27％,饲料70.3％～85.9％,牛乳83.47％～89.76％,鸡蛋76.2％～87.29％.确定可以利用此间接竞争ELISA方法检测样品中的三聚氰胺含量.     

鸡肝脏和肌肉组织中常山酮残留的ELISA检测

将常山酮进行人工改造,制备了半抗原常山酮琥珀酸衍生物（Hal-suc）.采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶联,制备免疫原和包被原.动物免疫6次后采血制备抗血清,以间接ELISA法测定血清效价,测得抗血清的最佳工作浓度为1∶102 400.建立了常山酮在鸡肝脏和肌肉组织中检测的ELISA法,该方法在50、100、500 ng/g 的添加浓度水平下,在鸡肝脏和肌肉组织中测得的平均回收率范围分别为74.2%～96.8%和74.3%～90.0%,检测限分别为28和19 ng/g.     

二氟沙星的应用研究概况

二氟沙星是新型动物专用的氟喹诺酮类抗菌药物,对畜禽许多致病菌和霉形体均有高度的杀灭作用。其药理与毒理性质国外进行了较为系统的研究,国内却较少研究。主要从药效学、药动学、毒理学及残留等方面对二氟沙星做一系统的阐述,为兽医临床提供资料。     

酶联免疫吸附法测定猪尿中安定的残留

用酶联免疫吸附法对猪尿中残留的安定进行检测,结果得出该方法的最低检出限为5．0μg/L;回收率在60％以上,批内变异系数≤17％,批问变异系数小于≤14％。表明该方法可用于安定残留量的筛选检测。     

牛奶中替米考星间接竞争酶联免疫吸附检测法的建立

本研究通过棋盘法优化替米考星抗体、包被原浓度,并考察了最佳包被条件,最佳反应温度、时间和酶标二抗最佳反应时间等,建立了替米考星残留的间接竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)并应用到牛奶样本的检测。建立的间接竞争ELISA方法半数抑制浓度(IC₅₀)为2.1 ng/mL,牛奶中替米考星的最低检测限(LOD)为2 μg/L。在5、10和20 μg/L添加浓度下,回收率为79.2%~90.1%,变异系数不高于9.0%。与其他常见的大环内酯类药物无交叉反应。本研究建立的替米考星间接竞争ELISA方法灵敏度达到了残留限量标准要求,为开发可用于牛奶中替米考星的快速检测试剂盒奠定基础。     

Establishment of Indirect Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Tilmicosin in Milk

An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting tilmicosin residue in milk was developed and applied to milk samples after the determination of dilution of coating antigen and antibody to timicosin by using checkerboard method,and the optimization of coating condition,reaction time and temperature,and reaction time of enzyme-labled secondary antibody.The results showed that the 50% inhibition concentration (IC₅₀) of the indirect competitive ELISA was 2.1 ng/mL and the limit of detection (LOD) of tilmicosin in milk was 2 μg/L.The recoveries of tilmicosin added in milk at 5,10 and 20 μg/L ranged from 79.2% to 90.1% with the coefficients of variation (CV) not higher than 9.0%.The indirect competitive ELISA would not react with other common macrolide drugs.The sensitivity of indirect competitive ELISA developed in the study complied to the maximum residue limit of tilmicosin set by China,and laid the foundation for the test kit of the rapid detection of tilmicosin in milk.     

猪表皮生长因子间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测猪血清或尿液中猪表皮生长因子(porcinee pidermal growth factor,pEGF)的含量,以pEGF为包被原,人表皮生长因子(hu-mane pidermal growth factor,hEGF)为竞争抗原,两者与一定量的抗pEGF多抗反应。结果表明,理想的包被抗原浓度为0.625μg/mL,抗pEGF工作浓度为1∶64000,酶标二抗工作浓度为1∶20000,可检测的最适范围为0.4ng/mL~32ng/mL,最低检测限为1ng/mL,批内和批间变异系数分别为3.50%和5.22%。得到回归方程y=-34.53x 76.06(R2=0.993)和标准曲线,从而建立了快速定量测定pEGF含量的酶联免疫吸附试验方法。     

氯霉素间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法的建立

以人工合成的氯霉素－牛血清白蛋白（CAP－BSA）为包被抗原，氯霉素（CAP）为竞争半抗原，两者与一定量的抗CAP－McAb反应。结果表明，理想的包被抗原质量浓度为1．25mg/L，抗CAP－McAb稀释倍数为1∶12000，酶标二抗稀释倍数为1∶5000，最适检测范围为1－100μg/L，最小检测为0．1μg/L，批内和批间变异系数分别为3．62％和5．19％。得到回归方程（y=1.2730-0.6745x,r^2＝0．9779）和标准曲线，从而建立了快速定量测定CAP含量的间接竞争酶联免疫吸附试验（ciELISA）。     

鸡肌肉组织中左氧氟沙星兽药残留ELISA检测方法的研究

用N-羟基琥珀酰亚胺法把左氧氟沙星（LVL）与牛血清白蛋白（BSA）偶联制备免疫抗原,免疫新西兰大白兔得到LVL的多克隆抗体,建立了LVL间接竞争ELISA方法。结果表明：抗LVL血清效价达1∶212以上,得到标准曲线的线性回归方程为y=-0.289 4x＋0.049 5（R2=0.987 8）,50%抑制浓度（IC50）为64 ng/mL,最低检测限（LOD）为10 ng/mL,标准曲线的线性范围为10～1 000 ng/mL。批内变异系数为3.51%～7.46%,批间变异系数为8.66%～11.89%,鸡肌肉中的LVL添加浓度在10～1 000 ng/ml范围内时,回收率为73.5%～84.36%。本试验建立的ELISA方法能够满足左氧氟沙星兽药残留检测要求。     

醋酸甲孕酮（MPA）间接竞争ELISA检测方法的建立

将半抗原醋酸甲孕酮（MPA）衍生物与牛血清白蛋白(BSA)偶联后，作为包被原与游离的醋酸甲孕酮竞争抗MPA多克隆抗体，通过该模式建立间接竞争ELISA方法检测MPA的残留量。试验结果表明：理想的包被抗原为0.625 μg/ml,抗体的工作浓度为1∶8000，标准曲线在1 ～50 ng/ml之间线性关系较好，最低检测限0.1 ng/ml, 得回归方程y=-1.1479x+0.9426(r2=0.9679),批内和批间变异系数分别为5. 35%、10. 89%。     

间接竞争ELISA检测兔肉中氯霉素残留方法的确定

建立了快速定量测定氯霉素(CAP)含量的间接竞争酶联免疫吸附试验方法。游离氯霉素与氯霉素辣根过氧化物酶标记物(HRP)在同一系统中竞争数量有限的氯霉素抗体结合位点,氯霉素酶标记物与氯霉素抗体结合的数量反比于游离氯霉素的数量。氯霉素浓度在0.2～20μg·ml-1范围内具有良好的线性关系回归方程为y=0.8327-0.5260x,r2=0.9862;测定低限为20ng·ml-1;方法平均回收率为83.5%,符合目前国际上氯霉素残留量检测的要求。     

肠炎沙门菌间批ELISA检测方法的建立

本试验建立和优化了重组蛋白rSEFA介导的间接ELISA方法以特异性检测肠炎沙门菌感染血清.确定其抗原最佳包被量为7.5 μg/mL,血清最适稀释度1:100,作用时间为60 min;酶标二抗最适稀释度为1:4 000,作用时间为60 min;判定标准为OD值≥0.346.基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性,能特异性识别肠炎沙门菌和都柏林沙门菌感染血清,不能识别相近的鸡白痢沙门菌感染血清,此方法与菌体凝集反应同时检测临床血清样品100份,二者阳性率分别为67%和54%,结果符合率为80.6%.这一方法的建立对肠炎沙门菌特异性抗体检测有潜在的应用前景.