奶牛α1-1抗胰蛋白酶及其基因多态性研究进展

α-抗胰蛋白酶是一种多功能糖蛋白。奶牛α1-抗胰蛋白酶编码基因多态性很高．并对奶牛经济性状具有重要意义。本文主要综述了α1-抗胰蛋白酶及其编码基因在奶牛上的研究进展。     

奶牛α1-抗胰蛋白酶及其基因多态性研究进展

α1-抗胰蛋白酶是一种多功能糖蛋白.奶牛α1-抗胰蛋白酶编码基因多态性很高,并对奶牛经济性状具有重要意义.本文主要综述了α1-抗胰蛋白酶及其编码基因在奶牛上的研究进展.     

重组奶牛干扰素-α基因的原核表达

从健康奶牛的血液中分离白细胞，用刺激物诱导白细胞产生干扰素，采用RT—PCR扩增干扰素-α基因，构建原核表达载体pQE30-IFNα，用IPTG诱导表达。得到重组的奶牛成熟干扰素-α基因全长498bp，构建的原核表达载体诱导6h后表达量较高，表达产物的分子量约为20kD，从而获得了表达奶牛干扰素-α的基因工程菌株。     

奶牛TLR4基因编码区生物信息学分析

TLR4基因在哺乳动物细胞表面有较高的表达量,在抗击感染性免疫中发挥重要的作用。本研究对奶牛TLR4基因编码蛋白质的结构和功能进行分析表明,奶牛TLR4基因编码区长度为3738bp,共1246个氨基酸残基,编码20种不同的氨基酸,α-螺旋(Hh)为329bp,延伸链(Ee)为30bp,自由卷曲(Cc)为378bp;编码蛋白原子数为13521个,其中H原子较多,分数正残数为0.09,等电点为6.74;分子体积为115841.00V/M,脂肪族指数105.75,其疏水性残基只有0.02。     

奶牛SP1基因结构及对乳脂合成功能的初步分析

旨在探讨中国荷斯坦奶牛的特异性蛋白1（specificity protein，SP1）基因结构特征及其对奶牛乳脂合成的影响。根据NCBI已经公布的奶牛SP1基因序列（NM_001078027.1），利用生物信息学分析其序列保守性、理化性质、蛋白亲水性、蛋白质结构及互作蛋白；采用PCR技术扩增并克隆SP1基因CDS序列。然后，选取6头健康的中国荷斯坦奶牛，分别取泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织，运用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测SP1基因在不同时期奶牛乳腺组织中的表达情况。分离并纯化泌乳期奶牛乳腺上皮细胞，通过SP1过表达及干扰检测其对乳脂合成的影响，分别进行3次独立试验。结果显示，SP1基因序列在不同物种间高度保守，与山羊相似度最高（98.94%）。奶牛SP1基因CDS区序列长2 361 bp，编码786个氨基酸，蛋白分子质量为80 902.17 u，理论等电点为6.94。平均疏水指数为-0.438，为不稳定的亲水性蛋白。SP1序列包含3个锌指结构，SP1蛋白二级结构以无规则卷曲（52.29%）为主。STRING蛋白互作分析结果显示，SP1与转录因子AP-1（JUN）、雌激素受体α（ERα）、MYC原癌基因蛋白（MYC）、TATA盒结合蛋白（TBP）等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示，SP1的mRNA和蛋白在泌乳期的表达量显著高于干奶期（P<0.01）。在奶牛乳腺上皮细胞中过表达SP1显著增加细胞甘油三酯的合成（P<0.01），而干扰SP1的表达，甘油三酯合成显著降低（P<0.01）。以上结果提示，SP1正向调控乳脂合成，分析SP1基因结构和功能为深入研究SP1对泌乳奶牛乳脂合成调控机制提供理论依据。     

牛αS1酪蛋白基因变异及其与生产性状的关系

αS1酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白,其基因的多态类型会影响奶牛的产奶性状和牛乳的一些加工特性,人们已经对其进行了广泛研究.牛αS1酪蛋白基因编码区全长17 508 bp(不计启动子序列),由19个外显子和18个内含子构成,外显子与内含子长度比例为1∶14.4.尽管其编码区突变率较高,但侧翼序列比较保守.到目前为止,牛αS1酪蛋白共发现有9种变异体,由核苷酸非同义替换、插入或缺失及外显子跳跃造成.牛αS1酪蛋白蛋白质序列及DNA序列的高度差异性揭示其编码基因可能是一个高速进化的基因家族.αS1酪蛋白基因与泌乳性状之间的关联性可以用基因调控区,特别是转录因子结合位点存在突变位点来解释.但是,有关牛αS1酪蛋白基因变异体还存在一些未探明的结果,因此,阐明其基因的结构特点并进一步揭示它们与生产性状之间的关系是非常必要的.     

奶牛CRY1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及组织表达谱研究

【目的】扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence, CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析,检测奶牛CRY1基因的表达谱,为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考。【方法】以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增CRY1基因CDS区,将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接,重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析。将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞,利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达;利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量。【结果】试验成功获得1 764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列,且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体。奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98%以上,且遗传距离较近。生物信息学...     

中国荷斯坦奶牛CCR5基因克隆、生物信息学及表达分析

试验旨在克隆中国荷斯坦奶牛CC趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type 5,CCR5)基因,对其进行生物信息学分析,并探究CCR5基因在奶牛炎性和健康组织中的表达水平。采用PCR技术扩增并克隆荷斯坦奶牛CCR5基因CDS区全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑方法筛选阳性克隆并测序,对序列进行相似性比对及系统进化树构建;应用多种在线生物信息学软件对其编码蛋白进行分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测CCR5基因在健康和炎症奶牛乳腺组织中的表达情况。结果显示,中国荷斯坦奶牛CCR5基因CDS区全长1 059 bp,编码352个氨基酸。相似性和遗传进化分析结果显示,奶牛CCR5基因与绵羊的遗传距离最近,高达96.0%,与鸡遗传关系最远,为61.0%,且在不同物种之间CCR5基因高度保守。中国荷斯坦奶牛CCR5蛋白分子质量为40.235 ku,理论等电点(pI)为9.30,为疏水性蛋白但不是分泌蛋白,主要存在于细胞质内;在CCR5蛋白二级结构中α-螺旋和无规则卷曲分别占51.14%和32.95%,三级结构模型预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,CCR5基因在健康奶牛乳腺组织中的表达量极显著低于炎性奶牛乳腺组织(P<0.01),提示其可能参与奶牛乳腺炎的发生过程。本试验结果为进一步研究奶牛CCR5蛋白的功能提供了理论依据,对探究奶牛CCR5基因在奶牛乳腺炎中的调控功能等具有重要意义。     

牛αS1-酪蛋白基因5'调控区的克隆与分析

编码乳蛋白的基因位于常染色体上,呈共显性遗传.牛酪蛋白基因位于基因组第6号染色体上,编码4种酪蛋白的基因在染色体上的位置依次是αS1-酪蛋白、β-酪蛋白、αS2-酪蛋白和γ-酪蛋白,表明这4种酪蛋白基因的表达受到共同的启动元件和调控元件的调控[1].研究通过数字化差异显示技术分析发现,牛αS1-酪蛋白基因在牛泌乳前后的乳腺组织中的表达量发生着显著的变化,表明αS1-酪蛋白可能与牛的泌乳调控有关.因此,试验克隆了牛αS1-酪蛋白基因5′调控区域,并进行了多种生物信息学分析,现报道如下.     

中国荷斯坦奶牛铁蛋白基因3'端克隆及序列分析

本研究旨在克隆和分析中国荷斯坦奶牛的铁蛋白(FTH)基因,为该基因的功能研究和有效利用提供理论依据.运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从公犊肝脏组织中扩增出FTH基因的3'端cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因的氨基酸序列进行分析.结果表明,FTH基因3'端cDNA全长为489 bp,编码81个氨基酸;经生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白无N端信号肽及跨膜区,相对分子质量为9.1253 kD,理论等电点为5.19,脂肪系数为85.56,总亲水性为-0.342,其一级结构中存在4个功能结构域;二级结构元件以α-螺旋和β-旋转为主;同源序列分析表明,中国荷斯坦奶牛与原牛FTH氨基酸的相似性最高(99％);系统进化树显示,在该基因座位上中国荷斯坦奶牛与所测物种的亲缘关系均较远.本研究有助于揭示FTH家族基因的进化历史,为对其进行深入的功能分析和利用研究提供参考.     

首例转基因羊降生北京顺义

三只名为“连连”、“田田”和“云云”的小山羊,今天憨态可掬地亮相于北京顺义三高科技农业试验示范区,这是我国首例3只转有人α抗胰蛋白酶基因的转基因山羊。由北京市科委、国家生物工程开发中心、顺义区政府支持,中国农大和北京兴绿原生物科技中心合作培育的转有人α抗胰蛋白酶基因的转基因山羊,采用显微注射法将修正的人抗胰蛋白酶基因导入山羊原核期胚胎内,经过两年多的努力,获取山羊卵1036枚,移植受体母羊近百只,最终获得两只母羊和两只公羊,其中一只名为“英英”的母羊于出生后三天死亡。据科研人员介绍,这三只转有人α抗胰蛋白酶基…     

牛源CCR7基因克隆、生物信息学及表达分析

【目的】 探究CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7,CCR7)基因编码蛋白的生物学特性及其mRNA在健康和炎性奶牛乳腺组织中的表达量。【方法】 使用PCR扩增并克隆中国荷斯坦奶牛CCR7基因CDS区,测序后进行相似性比对及系统进化树构建;使用多种生物信息学软件分析CCR7蛋白的组成、理化性质及结构等;使用实时荧光定量PCR技术检测CCR7基因在健康和炎性奶牛乳腺组织中的表达差异。【结果】 中国荷斯坦奶牛CCR7基因CDS区全长1 325 bp,与绵羊的相似性较高(95.2%),亲缘关系较近;与鸡的相似性较低(56.4%),亲缘关系较远。CCR7基因编码379个氨基酸,其中亮氨酸含量最多,缬氨酸含量次之,组氨酸和色氨酸含量最低;CCR7蛋白分子质量为14.56 ku,理论等电点为8.89,平均亲水系数为0.640,是一种跨膜疏水性蛋白。CCR7蛋白信号肽切割位点可能存在于第24和25位氨基酸之间。CCR7蛋白二级结构中α-螺旋占比最大,高达51.72%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。CCR7基因在炎性奶牛乳腺组织中的表达量极显著高于健康乳腺组织(P<0.01),其可能在奶牛乳腺炎的免疫调控中有着重要的作用。【结论】 试验成功克隆出牛CCR7基因CDS区序列,并进行了相应的生物信息学分析及组织定量表达,为进一步研究CCR7基因的具体功能提供材料,对于探究CCR7基因在奶牛乳腺炎中的调控功能具有重要的意义。     

牦牛α-干扰素基因的克隆及其原核表达的研究

植物血凝素（PHA）诱导培养牦牛外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT—PCR技术扩增牦牛IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ基因,分别经PCR、酶切鉴定及测序分析后,再分别构建原核表达重组质粒,用SDS-PAGE和Westernblot分析IPTG诱导表达的重组蛋白。序列分析表明,牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为570bp,与NCBI上发表的奶牛IFN-α-A参考序列同源性为94．4％,与黄牛INF-α-B基因（M10953）的同源性最高,为97．0％;牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为588bp,与NCBI上发表的奶牛IFN-α-Ⅱ参考序列同源性为94．2％,与黄牛IFN-δ—1基因（XM-871297）的同源性最高,为96．1％。分子遗传进化树分析表明牦牛IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ与黄牛、奶牛和水牛亲缘关系最近,与猪、马、人的次之,与其它动物都较远,说明这两基因均具有种属差异性。诱导表达重组蛋白分析表明,pGEX4T／IFN-α-A和pGEX4T／IFN-α-Ⅱ在大肠杆菌中得到了正确表达,均可表达约44ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,且具有与抗血清发生反应的生物活性。     

牦牛低氧诱导因子-1α基因克隆及蛋白质结构分析

试验采用RT-PCR方法,以麦洼牦牛脾脏cDNA为模板扩增牦牛低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因,并运用生物信息学软件对其序列进行分析。结果发现,扩增得到的麦洼牦牛HIF-1α基因编码区长为2 472 bp,编码823个氨基酸;蛋白质预测结果显示,该蛋白质分子质量为92.13 ku,等电点5.09,为亲水性蛋白,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,有69个磷酸化位点和4个N-糖基化位点;系统进化树显示,麦洼牦牛与牦牛、野牦牛、普通牛亲缘关系最近。本试验成功克隆麦洼牦牛HIF-1α基因并对其序列进行了分析,为进一步研究HIF-1α基因的功能提供参考。     

奶牛产奶性状有关基因的探索

产奶性状是奶牛生产中的重要数量经济性状,由微效多基因所决定。介绍了影响奶牛产奶性状的几个候选基因,如：α-酪蛋白基因,嗜乳蛋白基因、脂酰辅酶A甘油二脂酰基转移酶、垂体转录因子,骨桥蛋白基因,催乳素基因和催乳素受体基因等在奶牛生产中的研究和应用进展。     

运用多座位外显方差法分析中国荷斯坦牛CXCR1和IL8基因与乳房炎易感性的关系

旨在运用多座位外显方差分析法(MPVA)分析中国荷斯坦牛CXCR1和IL8两个基因多个突变位点多态性与乳房炎易感性的交互作用.本研究以南方某大型奶牛场634头(其中102头患乳房炎)中国荷斯坦牛为试验材料,采用PCR-SSCP和直接测序法分析CXCR1-5′端和编码区及IL8 2789/2862内含子3、外显子4和5,2个基因共7个SNPs位点的遗传多态性,并用MPVA法分析CXCR1和IL8基因各位点突变及其基因型组合对奶牛乳房炎易感性的影响.结果,MPVA分析发现CXCR1-1830、CXCR1-1768和IL8 2789/2862三位点交互作用对奶牛乳房炎易感性的影响达到显著水平.CXCR1-1830、CXCR1-1768和IL8 2789/2862三位点交互模型作为奶牛乳房炎易感性相关的基因联合选择模型最佳,MPVA可用于奶牛乳房炎易感性多基因分析模型.     

Leptin对奶牛乳腺上皮细胞主要乳蛋白基因表达的影响

本试验旨在研究不同处理浓度Leptin对奶牛乳腺上皮细胞中主要乳蛋白基因表达的影响。分别在有催乳素(PRL)(1μg/mL,+)和无PRL(0μg/mL,-)条件下进行,均以无Leptin组为对照组,10、100、1 000 ng/mLLeptin组为处理组。采用荧光定量PCR技术测定奶牛乳腺细胞中α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)和β-乳球蛋白(β-LGB)的基因表达。结果表明:无PRL条件下,Leptin未促进、甚至抑制奶牛乳腺上皮细胞中α-CN和β-CN基因的表达;有PRL条件下,Leptin极显著促进二者表达(P<0.001),以100 ng/mL处理组效果最显著;无论有、无PRL,Leptin均促进β-LGB基因的表达,但有PRL条件下,1 000 ng/mL处理组显著抑制β-LGB基因表达(P<0.001)。结果显示,有PRL条件下,Leptin促进奶牛乳腺上皮细胞主要乳蛋白基因的表达。     

FADS2基因在奶牛乳腺细胞中的过表达和干扰研究

为了研究脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturases 2,FADS2)基因在奶牛乳腺细胞脂肪酸代谢中的作用,本研究在奶牛乳腺上皮细胞中对FADS2基因进行过表达和干扰,研究FADS2基因表达对脂肪酸合成相关基因的调控及对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的影响。针对FADS2基因的CDS序列设计siRNA和过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP,转染奶牛乳腺细胞检测FADS2基因过表达和干扰对脂肪酸代谢相关基因表达的影响及细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示,试验成功获得过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP和干扰片段,转染细胞后具有良好的过表达和干扰效果。FADS2基因过表达后,1-酰基甘油磷酸酰基转移酶(AGPAT1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、3-磷酸甘油转移酶(GPAM)、脂肪酸延长链5(ELOVL5)、乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)、脂肪酸脱氢酶1(FADS1)、二酰基甘油转酰基酶1(DGAT1)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因显著下调(P<0.05),脂滴蛋白2(PLIN2)基因极显著上调(P<0.01)。FADS2基因干扰过后可引起AGPAT1、GPAM、ELOVL5、ACAA1、PLIN2和FADS1基因显著上调(P<0.05),脂肪酸合成胰岛素诱导基因1(INSIG1)极显著上调(P<0.01),DGAT1和PPARα基因显著下调(P<0.05)。甘油三酯检测结果显示,FADS2基因过表达和干扰均可降低奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,FADS2基因能调控脂质合成相关基因的表达,对乳腺脂质合成具有调控作用。     

牛β-防御素BNBD5基因在毕赤酵母中的表达

本研究在本实验室成功构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库的基础上,旨在通过对牛β-防御素基因的分析,进一步揭示乳房炎抗性的分子机理.以牛β-防御素BNBD5基因作为乳房炎抗性的候选基因,通过克隆该基因的编码区,成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA/BNBD5,并采用毕赤酵母表达系统表达了BNBD5蛋白.该结果为今后BNBD5抗体的制备奠定了基础.     

FADS2基因在奶牛乳腺细胞中的过表达和干扰研究

为了研究脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturases 2,FADS2)基因在奶牛乳腺细胞脂肪酸代谢中的作用,本研究在奶牛乳腺上皮细胞中对FADS2基因进行过表达和干扰,研究FADS2基因表达对脂肪酸合成相关基因的调控及对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的影响。针对FADS2基因的CDS序列设计siRNA和过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP,转染奶牛乳腺细胞检测FADS2基因过表达和干扰对脂肪酸代谢相关基因表达的影响及细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示,试验成功获得过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP和干扰片段,转染细胞后具有良好的过表达和干扰效果。FADS2基因过表达后,1-酰基甘油磷酸酰基转移酶(AGPAT1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、3-磷酸甘油转移酶(GPAM)、脂肪酸延长链5(ELOVL5)、乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)、脂肪酸脱氢酶1(FADS1)、二酰基甘油转酰基酶1(DGAT1)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因显著下调(P0.05),脂滴蛋白2(PLIN2)基因极显著上调(P0.01)。FADS2基因干扰过后可引起AGPAT1、GPAM、ELOVL5、ACAA1、PLIN2和FADS1基因显著上调(P0.05),脂肪酸合成胰岛素诱导基因1(INSIG1)极显著上调(P0.01),DGAT1和PPARα基因显著下调(P0.05)。甘油三酯检测结果显示,FADS2基因过表达和干扰均可降低奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,FADS2基因能调控脂质合成相关基因的表达,对乳腺脂质合成具有调控作用。