旋毛虫期特异性基因的筛选与鉴定

对旋毛虫新生幼虫 期特异性基因进行筛选与鉴定,结果表明:对新生幼虫cDNA文库进行核酸杂交筛选，获得7个阳性克隆，其大小在1.4 kb左右；用放射性同位素α³²P标记cDNA探针后，与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼虫、成虫/新生幼虫cDNA文库质粒DNA进行Southern印迹杂交，结果与成虫/新生幼虫、新生幼虫cDNA文库质粒DNA有杂交而与成虫、肌幼虫cDNA文库质粒DNA不杂交，因此该探针是新生幼虫期所特有的cDNA片段。     

猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建与筛选

在体外将猪带绦虫虫卵孵化为有活力的六钩蚴。采用商品化试剂盒抽提六钩蚴总 RNA、m RNA,反转录为双链c DNA,再加 Eco R Adapter。在去除小片段后 ,dsc DNA与 λgt11噬菌体 DNA连接 ,经蛋白包装 ,构建了猪带绦虫六钩蚴λgt11c DNA文库。该文库效价为 3.5× 10 9pfu/ m L ,重组 DNA片段大小为 0 .5～ 3.2 kb,平均为 1.6 kb,蓝白斑比 1∶ 9。用抗体探针对文库进行免疫学筛选 ,在消除非特异性反应的基础上筛选约 10 6 重组子 ,共得到 118株强阳性克隆 ;应用 PCR鉴定上述部分阳性克隆 ,均扩增到 0 .5 kb以上的片段。结果显示 ,构建的文库合格 ,含六钩蚴所有抗原基因 ,可用于六钩蚴 c DNA克隆的筛选 ;用免疫学与 PCR联合筛选 c DNA文库 ,可消除假阳性     

1型鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及基因组文库的构建

从临床病鸭中分离并鉴定了1型鸭疫里默氏杆菌,并在提取鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA后,用Sau3A I酶切,回收大小为0．07～4 kb的片段;将酶切片段与酶切的质粒载体pRSET连接后,电转化大肠杆菌Rosetta,成功构建了1型鸭疫里默氏杆菌的基因组文库,经检测库容量约为40000个。随机筛选30个单菌落,用pRSET通用引物进行PCR鉴定,统计结果显示插入片段的大小93．3％在1～3 kb范围内,成功构建了鸭疫里默氏杆菌基因组文库,为鸭疫里默氏杆菌功能基因的克隆及鉴定奠定了基础。     

猪肺炎支原体基因组DNA文库的构建

将猪肺炎支原体Z菌株接种于A26液体培养基中培养，在收获菌体细胞后，提取和纯化其基因组DNA。并经EcoRI大量酶切获得4．0－8．0kb的DNA片段，与λgtll载体臂连接为重组λDNA，然后进行包装，感染于Y1090宿主菌，构建了猪肺炎支原体基因组DNA文库，并得以表达。     

盐酸环丙沙星在患子宫内膜炎奶牛子宫内给药的药物浓度

本研究以反相高效液相色谱为定量分析手段，选用5头患子宫内膜炎的奶牛，通过子宫内灌注盐酸环丙沙星（2.5 g/头），研究了盐酸环丙沙星在患子宫内膜炎奶牛体内的药物动力学规律。以二氟沙星为内标，血浆样品经甲醇沉淀蛋白，离心，经针头式过滤器处理，用反相高效液相法测定其中盐酸环丙沙星的浓度。 色谱条件为：ODS-1C₁₈柱；测定流动相为0.015 mol/L四丁基溴化铵溶液-乙腈（92∶8，V/V），pH为3.0；流速为1.0 ml/min；荧光检测器，激发波长（λex）278 nm，发射波长（λem）465 nm。通过采用MCPKP房室分析程序，分析血中浓度 时间数据，发现有3头奶牛血样药时数据符合无吸收三室开放模型。其血样中主要药动学参数为：T_1/2α为0.916 h、T_1/2β为49.20 h、AUC高达7.6296 mg/L·h、Clβ为1.582 L/kg·h，β为0.642 h^-1。有2头奶牛血样药时数据符合一级吸收二室开放模型。其主要药动学参数为：T_1/2α为1.26 h、T_1/2β为9.2 h、AUC高达28.336 mg/L·h，β为0.3571 h^-1。试验结果表明，盐酸环丙沙星子宫给药吸收快，分布广，消除慢。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库构建及其特异性基因的筛选与鉴定

构建旋毛虫新生幼虫cDNA文库并对旋毛虫新牛幼虫期特异件基因进行筛选与鉴定,筛选出期特异性的基因片段.用λZAPⅡExpress载体成功地构建了旋毛虫新生幼虫的cDNA文库,并用放射性同位素a-38P标记cDNA探针对筛选出的阳性克隆进行鉴定.所构建的cDNA文库容量为1.92×106,重组效率为98.6%,所有的克隆片段都在0.5～2.0 kb之间,筛选获得7个阳性克隆,其大小在1.4 kb左右;用放射性同位素a-32P标记cDNA探针后,与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼虫及成虫/新生幼虫cDNA文库质粒DNA进行Southern印迹杂交,结果与新生幼虫和成虫、新生幼虫cDNA文库质粒DNA有杂交而与成虫、肌幼虫cDNA文库质粒DNA不杂交.该基因是新生幼虫期所特有的cDNA片段.     

瘤胃中小韦荣球菌H2基因文库的构建

为了构建小韦荣球菌H2基因的文库,研究提取小韦荣球菌H2总基因组,采用机械剪切方法获得DNA随机片段,将获得的DNA片段与Sma Ⅰ酶切质粒pUC18体外连接并电转化至大肠杆菌DH5α,在含有IPTG、X-gal和氨苄西林的LB琼脂平板上用蓝白斑法筛选含重组质粒的大肠杆菌,并进行扩增分析.结果表明:重组质粒经鉴定分析证实包含小韦荣球菌H2的3～4 kb插入片段,文库滴度为1×105 pfu/mL;根据公式N=ln(1-p)/(1-f)证明99%基因组包含在文库中.     

家蚕微孢子虫细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。     

一株偶发分支杆菌基因组文库的构建

对一株致病性的非结核分支杆菌(NTM)即偶发分支杆菌(M.fortuitum)建立基因组文库,选用同尾酶Sau3 A I和BamH I分别酶切基因组DNA和载体pUC18,回收1 kb～7 kb大小范围的插入性DNA片段,与已经酶切去磷酸化的载体用T4连接酶连接,并转化入DH5а感受态细胞中,进行蓝白斑和氨苄抗性筛选,...     

A cloned DNA probe for the detection of Mycobacterium paratuberculosis

DNA extracted from Mycobacterium paratuberculosis, which had been isolated from a cow with clinical Johne's disease, was used to make a gene library in the Escherichia Coli expression vector phage lambda gt11. Plaque-lifts were made from the library onto nitrocellulose membranes. These were screened by differential hybridization using radiolabelled chromosomal DNA from M. paratuberculosis and Mycobacterium phlei. By this method six recombinants that hybridized to M. paratuberculosis but not to M. phlei were identified. Three of these, designated lambda gt-R3, lambda gt-R4 and lambda gt-RS, containing DNA inserts of 2.5,1.5 and 3.7 kilobases (kb), respectively, were chosen for further analysis of their insert specificities. Following restriction with the endonucleases EcoRI and BamHI, the digestion fragments from the three recombinants were transferred to nitrocellulose membranes and probed with radiolabelled DNA from M. paratuberculosis and M. phlei. As expected, M. paratuberculosis DNA hybridized to all the fragments. M. phlei DNA hybridized to both the fragments that were generated from lambda gt-R3, to the single fragment from lambda gt-R4 and to two of the three fragments generated from lambda gt-RS. The fragment with which M. phlei DNA failed to hybridize was 0.45 kb in length. Multiple copies of this fragment were made in the plasmid pGEM-2; the plasmid DNA was then harvested and radiolabelled. Designated PAM-1, the radiolabelled material hybridized to a 3.7 kb fragment of EcoRI-digested M. paratuberculosis and to 2.2 kb fragments of similarly digested M. avium serovars 2 and 3. PAM-1 did not hybridize to DNA from the other four mycobacterial species examined or from Nocardia asteroides. The restriction fragment length polymorphism thus demonstrated distinguishes M. paratuberculosis from M. avium serovars 2 and 3.     

饲料添加剂碱式氯化锌合成新工艺探索及研究

该试验采用氨氯化铵浸出法浸取次氧化锌,制备饲料添加剂碱式氯化锌(ZnCl₂·4Zn(OH)₂·H₂O)。研究结果表明,在浸出条件为氨与铵根摩尔比为1∶1、总氮与锌摩尔比为10∶1、温度为313 K、时间为60 min时,Zn的浸出率达90%以上。同时,对合成产品进行了主含量、XRD、SEM分析,结果显示产品各项指标均符合GB/T 22546-2008要求。试验还表明该工艺具有方法新颖、流程简单、成本低、安全、高效、环保等特点,从根本上实现了废物资源化的利用,同时还可以生产出质量合格、稳定的新型饲料添加剂碱式氯化锌。     

蜜蜂球囊菌全长cDNA文库的构建与分析

本试验利用TRIzol试剂盒提取蜜蜂球囊菌总RNA,通过Oligotex纯化试剂盒将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得蜜蜂球囊菌cDNA原始文库,其滴度测定为1.6×106PFU/mL,扩增后的滴度是1.5×109PFU/mL;取适量扩增文库稀释并铺平板,蓝白斑筛选独立噬菌斑,用M13±通用引物进行PCR扩增后,文库的重组率达到90%,插入cDNA片段的长度在0.5~2 kb。该文库的构建,有利于筛选目的基因,便于深入研究蜜蜂白垩病的侵染机制,最终有效防制白垩病。     

Detection of infectious laryngotracheitis virus infected cells with cloned DNA probes.

A genomic library of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) DNA BamH1 fragments was prepared and two cloned fragments were evaluated for their potential as probes for the detection of ILTV infected cells. The virus was purified by a modified sucrose density gradient procedure for the isolation of pure ILTV DNA. A genomic library was constructed using BamH1-digested ILTV DNA and pGEM7 as a vector. A 1.1 kb cloned BamH1 fragment of ILTV DNA was tested in a slot or dot blot assay for the detection of ILTV infected cells. The limit of detection for this probe was at least 0.12 ng of pure ILTV DNA. The probe was able to identify both chicken embryo liver (CELi) cells and choriallantoic membranes infected with ILTV. Chicken embryo liver cells infected with several field isolates and a vaccine strain of ILTV were positive by dot blot analysis using this probe. Some qualitative differences in the degree of hybridization to cells infected by different ILTV isolates were observed. Uninfected cells and cells infected with fowlpox virus, turkey herpesvirus, Marek's disease virus or Newcastle disease virus were negative by the same assay. Compared with the 1.1 kb fragment, a larger 6 kb cloned BamH1 fragment of ILTV DNA showed a stronger hybridization signal to DNA from ILTV infected cells.     

中药复方总化学成分(浸膏)提取工艺研究

本研究旨在提高白花蛇舌草、金银花、黄芪、甘草组成的中药复方的临床疗效和抗病毒作用机理研究,为复方剂型改革和工业化生产提供科学依据。采用正交设计结合单因素考察,对复方水提和醇沉工艺进行优化:以水提后的浸膏重量为考察指标,选用L₉(3⁴)正交表设计试验,对浸泡时间、用水量、煎煮时间、煎煮次数4个因素进行优化;采用HPLC法测定复方浸膏中的甘草酸含量作为醇沉优化指标,选用L₉(3⁴)正交表设计试验,对乙醇浓度、乙醇用量、醇沉时间3个因素进行优化。结果得到复方水提最佳工艺:浸泡1 h、12倍加水量、煎煮4次、煎煮时间1.5 h;浸膏醇沉最佳工艺:80%乙醇浓度、4倍乙醇量、醇沉16 h。结合实际生产和成本因素,确定中药复方水提和醇沉工艺为:浸泡0.5 h、12倍加水量、煎煮3次、煎煮时间1 h,65%乙醇浓度、3倍乙醇量、醇沉16 h,水提浸膏收率为57.2%,醇沉浸膏甘草酸含量为0.42%,均接近正交方案中的最高值。     

规模化养猪场环境细菌的调查与分析

为掌握规模化养猪场周围环境中的细菌数量与种类,以便为养猪场细菌性疾病的预防与控制提供依据,本试验在贵州省2个具有代表性的规模化养猪场中采集空气、饮用水、排污水、土壤和粪便样本进行细菌总数检测和优势菌落鉴定,结果显示,2个猪场的空气、饮用水、排污水、粪便和土壤样本细菌总数相应为(1.17~94.40)×10⁴ CFU/m³、(0.15~1.83)×10² CFU/mL、(5.00~32.00)×10⁵ CFU/mL、(0.46~26.40)×10⁶ CFU/g和(0.30~52.30)×10⁵ CFU/g,主要优势菌是葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森菌、变形杆菌、巴氏杆菌、李氏杆菌、芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌等。这些结果显示,除饮用水和土壤外,其余样本的细菌总数都符合国家规定的畜禽养殖场环境卫生要求,但存在一些条件致病菌或致病菌,这为养猪场细菌性疾病的预防与控制提供了重要的参考数据。     

产后骨关节炎患牛血液生化指标的研究

通过对产后15~20 d、跗关节炎患牛与正常奶牛血清中蛋白、甲状腺素(T₃、T₄)、维生素、葡萄糖、乳酸、丙酮酸、Ca、P等生化指标的比较,探讨血液生化指标的变化与奶牛骨关节疾病的关系。结果表明,试验组血清白蛋白显著低于对照组(P<0.05),而α-球蛋白显著高于对照组(P<0.05);试验组T₃水平显著高于对照组(P<0.05),T₄显著低于对照组(P<0.05);试验组乳酸和丙酮酸水平显著高于对照组(P<0.05);试验组血糖、VA、VC、VE及Ca、P含量均显著低于对照组(P<0.05),说明产后关节炎过程中T₄、VA、VC的含量降低使关节软骨的胶原及蛋白多糖合成减少,解聚相对增多,引起血清蛋白组成发生变化;而产后血糖水平降低,引起乳酸、丙酮酸含量升高,低血糖又抑制了VC的合成;关节炎过程中可见Ca、P水平降低,可能是通过影响骨质代谢而促进了关节炎的发生。     

鸭肝炎病毒A66株部分cDNA文库的构建与序列分析

本研究根据已发表的小核糖核酸病毒（picornavirus）核苷酸序列设计4对引物。以RNAiso Reagent试剂抽提含DHV A₆₆鸡胚尿囊液总RNA ，用TakaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0试剂盒进行RT-PCR扩增，将所得PCR产物回收并克隆于pMD18-T 载体、转化感受态细菌DH5а，利用氨苄青霉素筛选阳性克隆子, 经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定重组质粒。取重组阳性质粒进行测序，测序结果与近期GenBank登录的3株Ⅰ型DHV核苷酸序列比对，结果显示与03D株、H株、5886株鸭肝炎病毒的核酸序列同源性分别为96.8%、96.3%、96.2%，表明成功构建了DHV A₆₆ 株部分cDNA文库。     

鹅大肠杆菌油佐剂灭活疫苗的研制

从湛江地区疑似大肠杆菌病的病死鹅组织中分离鉴定2株致病性大肠杆菌O₈₆K₆₁和O₄₄K₇₄,以此制备油佐剂灭活疫苗。用上述疫苗接种20日龄雏鹅,35日龄加强免疫一次,分别于27、35、42、50日龄检测免疫鹅血清抗体水平,并进行攻毒保护试验。结果表明,制备的大肠杆菌油佐剂灭活疫苗安全可靠,免疫后15、30 d后,免疫鹅血清抗体水平分别达到1∶32和1∶128;且免疫鹅能抵抗10¹⁰/mL的致病性大肠杆菌攻击,对照组鹅全部发病,有明显临床症状,从发病鹅组织中分离到致病性大肠杆菌。