牛SOCS5基因5′调控区多态性研究

【目的】筛选SOCS5基因启动子区多态位点（SNP）,并研究其对启动子功能元件的影响。【方法】选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池。直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响。【结果】牛SOC5基因5′调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为：C-577T、T-43C和C＋61T,其中C＋61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点。生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS基因表达水平。【结论】牛SOCS5基因5′调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点。     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至 7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含"GC"碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至+7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含“GC“碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

牛BMP15基因5′UTR区克隆及生物信息学分析

研究克隆了牛BMP15基因5′UTR区1350 bp的基因组序列,利用promoter在线工具分析发现,在扩增片段的255~305 bp处存在可能的启动子位点;利用TFSEARCH在线程序发现该段序列上有35个评分在90分以上的潜在的转录因子结合位点,其中评分在95分以上的有5个。在这些转录因子的结合位点中,部分与启动子有关(如GC-box等),但没有发现对转录有重要调控作用的TATA-box。     

NCOA1基因多态性与邵伯鸡父系公鸡精液品质相关性分析

采用PCR-SSCP技术检测优邵伯鸡父系公鸡NCOA1基因的SNPs,并分析其与精液品质的关联性.结果表明,第3外显子区域10155007位点发生了T→A突变,检测到AA、AB、BB 3种基因型;第10外显子区域108273257位点发生了T→C突变,检测到SS、ST、TT 3种基因型; 第12外显子区域108273423位点发生了C→T突变,检测到CC、CD、DD 3种基因型.AA型个体的精液量显著高于BB型个体(P<0.05),精子密度显著高于AB型个体(P<0.05),但AA型个体与BB型个体间精子密度无显著差异(P>0.05).CC、CD、DD型个体间精液量差异均不显著(P>0.05),但CC型个体的精子密度显著高于DD型个体(P<0.05).SS、ST、TT基因型个体间的精液量及精子密度均无显著差异(P<0.05).上述所有基因型个体间的精子畸形率及精子活力差异均不显著(P>0.05).AACC基因组合型个体的精液品质最好,其在精液量、精子密度方面均显著地优于BBDD基因组合型个体(P<0.05).研究结果显示,NCOA1基因可能是影响公鸡精液品质性状的主效基因或与控制该性状的主效基因连锁,能够作为候选基因用于精液品质的分子标记辅助选择.     

FSHβ基因与公鹅精液品质性状的关联分析

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测了143只籽鹅公鹅FSHβ亚基基因内含子2上SNP(C126T)的多态性,并分析了该SNP位点与精液品质性状(精液体积、精子密度、精子畸形率和精子活率)的相关性。结果显示FSHβ亚基基因内含子2的C126T突变产生三种基因型:CC型、CT型和TT型,其基因型频率分别为0.08、0.44和0.48;TT型精液体积显著高于CC型和CT型(P0.05);CC型和TT型个体的精子密度显著高于CT型(P0.05),CC型和TT型之间差异不显著(P0.05);TT型和CT型的精子活率差异不显著(P0.05),但显著高于CC型(P0.05)。在FSHβ亚基基因第2内含子SNP(C126T)位点,TT型是精液品质性状的优势基因型。FSHβ基因在公鹅精子生成的过程中可能有重要的调控作用。     

雪峰乌骨鸡HSP70基因多态性与精液品质关联分析

旨在研究雪峰乌骨鸡HSP70基因多态性及其与鸡冻精品质的关系,以期筛选出鸡精液抗冻性相关分子标记,为鸡精液冷冻保存及其分子育种提供技术支撑。选取100只同一批次、性成熟的白羽雪峰乌骨种公鸡,测定采精量、精子密度和冻精活力等指标。翅静脉采血,提取基因组DNA并扩增HSP70基因,构建精液品质低、中、高3个混池并测序。单个样本测序后,比对测序峰图,完成基因分型,统计不同基因型个体数,并进一步进行精液品质关联分析。结果发现:HSP70基因436 bp处存在G>A突变,G为优势基因,将群体分成AA、AG和GG这3种基因型,各基因型频率依次为22%、44%和34%,该位点遗传多样性分析PIC=0.371 4,为中度多态位点,Hardy-Weinberg平衡适合性检验得χ²=1.148 0(P>0.05),该群体符合Hardy-Weinberg平衡规律。基因多态与精液品质关联分析表明,GG基因型个体采精量和精子密度极显著(P<0.01)高于AG型、AA型个体,且冻后活力显著(P<0.05)高于AG型个体,极显著(P<0.01)高于AA型个体;AG型个体采精量和精子密度极显著(P<0.01)高于AA型个体,冻精活力差异不显著(P>0.05)。综上所述,HSP70基因突变G/A位点与鸡冻精品质显著相关,可以作为雪峰乌骨鸡个体精液抗冻性的候选基因,基因型GG的个体精液更具抗冻性,其次为AG型个体。     

中国小尾寒羊FSHR基因部分序列的克隆与分析

利用PCR技术扩增了中国小尾寒羊FSHR基因5′端调控区和部分结构区序列，并通过克隆进行了序列测定。比较研究结果：中国小尾寒羊与澳洲绵羊的FSHR基因在5′端有4个位点发生了单碱基插入／缺失（或缺失／插入）突变，序列间的保守性为97．99％；碱基变异率相应为2．01％。而二者在结构基因扩增区域的碱基变异率仅0．36％。有2个位点的减基变异引起了氨基酸密码改变。     

小鼠ISG15基因5′调控区序列的克隆及序列分析

采用LA-PCR技术扩增小鼠ISG15基因1194bp的5′调控区序列,构建了重组克隆载体pEGFP-N1-ISG15,对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析。结果表明:试验成功构建了包含小鼠ISG15基因5′调控区的重组质粒;经同源性比对发现ISG15基因5′调控区在不同物种中同源性不高,在转录起始位点近端的启动子区域中小鼠与人、牛、乌鳢的同源性分别为41.36%,37.89%,38.71%;经过预测该调控区富含GAS、GR、SP1、NF-1、CBF-B等转录因子结合位点,有五处Enhancer区、一处ISRE元件以及一处保守的NF-κB结合位点。本研究为进一步确定小鼠ISG15基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。     

热应激对南阳牛种公牛精液品质的影响及对策

随着全球温室效应的增加,夏季高温作为一种热应激源严重影响南阳牛种公牛精液品质.本文简要分析热应激对南阳牛种公牛精液品质的影响,并提出对策措施,以期为生产实践提供参考.     

牛SOCS5基因5'调控区多态性研究

[目的]筛选SOCS5基因启动子区多态位点(SNP),并研究其对启动子功能元件的影响.[方法]选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池,直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响.[结果]牛SOCS基因5调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为:C-577T、T-43C和C+61T,其中C+61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点.生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS5基因表达水平.[结论]牛SOCS5基因5'调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点.     

牛β-乳球蛋白基因5′调控成分的分离、克隆及序列分析

利用PCR方法克隆了牛β-乳球蛋白基因5′调控成分(1 449 bp),其中包括5′侧翼序列(645 bp),第一外显子及第一内含子(804 bp).PCR产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector的T位点.序列分析表明,该序列与牛β-乳球蛋白A型基因、牛β-乳球蛋白B型基因、山羊和绵羊β-乳球蛋白基因的同源性分别为98.55%,99.79%,90.70%和90.09%.计算机分析表明,此调控成分含有诸多调节因子结合位点或反应元件,其中包括视黄酸反应元件(RARE)、佛波酯反应元件(TRE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,提示此调控成分可调控外源基因在乳腺细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体.     

牛线粒体CYTB基因的序列分析及进化关系

对CYTB基因全长1140bp序列进行分析的结果表明，10个品种的20条CYTB碱基序列中共发现10种单倍型，黄牛中单倍型较少．共检测到98个变异位点，未发现插入和缺失，牦牛和黄牛除了异亮氨酸以外有着相同的密码子偏好．将核酸序列转换成氨基酸序列后，黄牛表现的遗传差异更小，18个个体分享5种氨基酸序列单倍型，共有6个氨基酸突变位点，8个突变氨基酸．     

5′UTR序列对DR5GUS基因瞬时表达的影响

利用生长素响应原件(DR5)构建了DR5::GUS报告基因表达载体,并在载体构建时,对GUS的5′UTR序列进行2种设计:一种是利用载体GUS基因原有的5′UTR构建成pBI121-DR5::GUS;另一种采用植物增强表达的常用原件烟草花叶病毒(TMV)的5′端序列(Ω′)替换GUS基因原有的5′UTR序列,构建成pBI121-DR5(Ω′)::GUS。将2种载体转化根癌农杆菌后,采用烟草叶片注射浸染的瞬时表达检测法对2个载体的植物表达效果进行检测,2种载体分别转化烟草叶片2 d后,对浸染的叶盘进行GUS染色分析,pBI121-DR5::GUS的转化叶片有明显的GUS反应,而pBI121-DR5(Ω′)::GUS的转化叶片则无GUS反应。分离注射浸染部位叶盘RNA后,对GUS特异引物进行RT-PCR分析,2种转化的基因都已有效转录出RNA,但前者能翻译出相应的Ω-葡萄糖苷酸酶,后者则不能完成翻译过程,说明Ω′序列的引入并未有效提高GUS基因的表达,反而抑制了mRNA的翻译。     

樱桃谷鸭IP3R3基因多态性与蛋壳品质的关联分析

为了探究三磷酸肌醇受体3型(IP3R3)基因多态位点对蛋鸭蛋壳品质的影响,试验以樱桃谷鸭为材料,收集45周龄鸭蛋测定蛋质量、蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋壳质量5个指标,并与突变位点进行关联性分析.结果显示,在IP3R3基因中检测到2个SNP位点,分别为第6外显子的g.5539186 T>C突变和第8外显子的g.55...     

牛整合素β5亚基基因的构建与原核表达

[目的]构建牛整合素β5亚基（ITGB5）基因,并进行原核表达。[方法]扩增目的基因,将其重组到pET-32a（＋）质粒中,将经鉴定为阳性的重组克隆,转化大肠杆菌感受态细胞表达蛋白后纯化。[结果]从牛甲状腺、扁桃体扩增到目的基因ITGB5;ITGB5基因表达产物的SDS-PAGE结果显示,在88 KD处出现表达产物及纯化后的蛋白;W estern-blot分析表明,抗血清可与原核表达的蛋白特异性结合。[结论]表达、并纯化了ITGB5蛋白。     

宣和猪PLIN2基因5′-UTR和3′-UTR多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】揭示PLIN2基因对宣和猪生长性状的影响。【方法】以357头宣和猪为试验材料,采用PCR产物直接测序法检测了PLIN2基因的5′-UTR和3′-UTR多态性,分析了各SNP位点不同基因型的生长性状差异。【结果】在5′-UTR检测到2个SNP位点(G158A、T491G)、3′-UTR检出1个SNP位点(G5689A),上述3个SNP位点分别以GG、TT和GG基因型频率最高,G、T和G为优势等位基因;除G158A位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)外,其余2个突变位点均处于平衡状态(P>0.05),且杂合度较高、遗传多样性较为丰富。在6月龄体重、4—6月龄日增重和70日龄—6月龄日增重上,G158A位点的GG型、T491G位点的TT型和G5689A位点的GG型均显著高于同位点其他基因型(P<0.01或P<0.05);且3个SNP位点不同单倍型组合对生长性状的影响呈现了明显的协同作用,即GTG/GTG组合的6月龄体重、4—6月龄日增重和70日龄—6月龄日增重最高(P<0.01或P<0.05)。【结论】研究结果从PLIN2...     

公牛HSP基因多态性与其精液品质及后裔性能的相关分析

以142头公牛为研究对象,以HSP为耐热性状的候选基因,分别扩增125和233 bp 2个片段,采用PCR-SSCP方法检测HSP基因多态性,并对PCR产物测序和序列分析。结果表明:HSPA8存在T3358C转换突变,该突变使缬氨酸(Val)变为异亮氨酸(Ile),产生2种基因型AA和AB,频率分别为0.577 5和0.422 5;HSPA1A发现A6201C和T6202A颠换突变,其中T6202A突变使苯丙氨酸(Phe)变为异亮氨酸(Ile),产生了5种基因型AA、AB、BB、AC和BC,频率分别为0.345 1、0.493 0、0.084 5、0.035 2和0.042 2。应用SPSS17.0软件采用最小二乘拟合线性模型,分析基因座位不同标记基因型与后裔测定性能和精液品质的相关性,结果表明:1)在HSPA8,AA基因型个体产量育种值显著高于AB型(P<0.05);在HSPA1A,BB基因型个体产量育种值显著高于AC型(P<0.05),AB基因型个体蛋白育种值显著高于AC型(P<0.05)。2)在HSPA8,精子密度、精子活力和顶体完整率AA均显著高于AB(P<0.05),而精子畸形率AA显著低于AB(P...     

牛精液中IBRV荧光PCR检测方法的建立及精液带毒与血清抗体的关系

【目的】建立牛精液中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光PCR检测方法,并分析精液带毒与血清抗体的关系,为牛精液中IBRV的荧光PCR诊断和判定提供技术依据。【方法】采用Sephycral S-400凝胶过滤法和蛋白酶K预消化法,分别对新鲜牛精液和冻存牛精液进行处理,用DNA Zol方法提取病毒核酸,通过PCR反应条件的优化,建立了牛精液中直接检测IBRV的荧光PCR方法,对该方法进行特异性和重复性检验;最后用该方法分别对120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液进行检测,同时用普通PCR方法和病毒分离方法加以对比;并对其中的10头牛定期采集精液、鼻腔拭子和血清样品,用该荧光PCR方法进行病原检测,对血清样品进行IBRV抗体检测。【结果】建立的荧光PCR方法具有较好的特异性,重复性和稳定性很好。用该方法可检测到新鲜牛精液中0.002 TCID50的病毒粒子,检测到冻存牛精液中0.02 TCID50的病毒粒子,检测时间在3 h之内,是OIE已报道方法灵敏度的40~400倍,是病毒分离方法灵敏度的100倍。120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液中,检测到阳性样品25份,用普通PCR检测得到阳性样品15份,病毒分离检测得到阳性样品12份。检测结果表明,精液为阳性的牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性的牛精液中也不一定携带病毒。【结论】建立了牛精液中IBRV的荧光PCR检测方法;通过分析精液带毒与血清抗体的关系,进一步表明不能简单地以血清抗体阴阳性作为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒具有间歇性。     

奶牛pIgR基因5′侧翼区SNP检测及其与IgA和IgM含量的相关性研究

本试验研究了pIgR基因5′侧翼区的多态性及其对IgA和IgM含量的影响。从NCBI上的Map Viewer数据库下载牛pIgR基因的5′侧翼区的序列（NW_174143）,长度为3.2 kb,设计4对引物进行PCR扩增,通过对25头奶牛的PCR产物直接测序发现并确定SNP位点,并用SNP Stream标签微列阵基因分型系统对189头牛进行基因分型,将其与牛奶和血液中的IgA和IgM的含量进行关联分析。结果表明,pIgR基因在-3128、-3072、-2834、-2348和-515位发现了5个SNP位点,其中SNP1和SNP2为A/G突变,SNP3、SNP4和SNP5为T/C突变。方差分析结果表明,SNP1对牛奶IgM和血液IgA含量有显着的影响（P〈0.05）,SNP3和SNP5对血液IgM含量有显着影响（P〈0.05）,其他SNP位点与单倍型组合对乳及血液中IgA和IgM的含量均没有显著影响（P〈0.05）;多重比较分析表明,SNP1位点的基因型AB个体与BB个体的牛奶IgM和血液IgA含量的最小二乘均数差异显著（P〈0.05）,SNP3和SNP5的不同基因型对血液IgM含量的最小二乘均数分别达到了显著水平（P〈0.05）。因此得出,牛pIgR基因5′侧翼区的多态性影响牛奶和血液中的IgA和IgM的含量,这为进一步研究牛奶中IgA和IgM分泌转运机理提供了理论依据。