一种制备富含多糖丝状真菌基因组DNA的方法

采用改进CTAB法提取的红曲霉、镰刀菌和微小毛霉基因组DNA数量和质量都较为理想,DNA产量在90～130 μg·g-1湿菌体,大小均在21kb.4℃可保存4～6个月.用该方法提取的基因组DNA为PCR扩增的模板,扩增结果稳定、准确.分别用限制性内切酶SacⅠ、HindⅢ、BamHⅠ酶解红曲霉M34均能得到较为均一的完全酶切带.该方法快速、简便,成本低,适合富含色素和多糖的真菌的基因组DNA的提取.此外,还适合真菌分子育种等的筛选和样本量大的PCR检测.     

单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较

为了选择一种简单、快速、有效的单增李斯特菌基因组DNA的提取方法,采用溶菌酶-蛋白酶K法、氯仿/异戊醇法、液氮冻融法提取单增李斯特菌基因组DNA,利用PCR扩增结果判断所得DNA样品的质量.结果为,3种不同方法均能扩增出234 bp条带,溶菌酶一蛋白酶K法提取的DNA模板检出限最低,为1.25 x 10,CFU/mL.结论为,溶菌酶-蛋白酶K法提取的DNA模板进行PCR扩增检出限最低,该方法提取的基因组DNA适用于PCR扩增和其他分子生物学研究.     

适用于SSR-PCR试验的水稻基因组DNA提取方法的比较

为了寻找操作简便、耗时短、成本低的适用于简单重复序列-聚合酶链式反应(SSR-PCR)试验的水稻基因组DNA提取方法,试验以3种类型的水稻样品(叶片、米粒、米粉)为材料,比较了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、试剂盒法、蔗糖法、碱法4种基因组DNA提取方法对水稻基因组DNA提取质量的影响.结果表明,CTAB法提取的叶片、米粒和米粉的基因组DNA含量最高,其次为试剂盒法提取的叶片、米粉和碱法提取的米粉的基因组DNA含量.通过4种方法得到的水稻基因组DNA纯度均不高,但不影响后续的SSR-PCR试验.SSR-PCR结果表明,CTAB法、试剂盒法和碱法提取的3种样品类型的水稻基因组DNA的扩增均表现出了良好的重复性.其中试剂盒法的提取成本最高,CTAB法耗时最长.整体而言,碱法是最适合水稻SSR-PCR试验的基因组DNA提取方法,且以米粉为提取材料时效果最佳.     

一种简易有效的提取真菌DNA化学改良方法

[目的]探索适合真菌基因组DNA提取的有效方法。[方法]以酵母茵（Hansenula sp.HS07A）和青霉菌（Penicillium sp.HS07）为供试菌株,分别采用煮沸裂解法、石英砂研磨法、研磨和反复研磨冻融法和化学改良法提取其基因组DNA,比较这4种方法的提取效果。[结果]化学改良法提取基因组DNA,除去了机械破壁过程,减少了机械力对DNA造成的破坏,运用阴离子去污剂SIB提取DNA安全、价廉,能有效、完整地提取高质量的基因组DNA,凝胶电泳条带清晰、无弥散,以此基因组DNA作为目的片段的PCR扩增模板,扩增效果优于改良前的方法,并且这种方法也适合多种真菌和细菌基因组DNA的提取。[结论]化学改良法是提取真菌基因组DNA的有效方法。     

3种桑蟥基因组DNA提取方法比较研究

为了探寻一种高效、稳定、廉价的桑蟥基因组DNA提取方法,通过采用CTAB法、蛋白酶K法和盐析法3种方法研究桑蟥基因组DNA的提取。对提取的DNA进行分光光度值的测定以及COI基因的扩增鉴定。结果表明：3种方法均可以提取基因组DNA,蛋白酶K法和CTAB法DNA获得率优于饱和NaCl法提取的DNA,3种方法提取的DNA都可用于PCR扩增实验。因此,在实际工作中可根据实验目的、条件选取最适合的方法。     

枸杞基因组DNA提取方法比较

以拘杞叶片为材料,分别采用优化后CTAB法、KI法、尿素法、高盐低pH法以及SDS法提取拘杞基因组DNA,分别进行琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计以及PCR扩增进行检测.研究结果表明,5种方法均能从枸杞叶片中提取到基因组DNA,但不同方法在提取时间和提取得到的基因组DNA的纯度和浓度上存在明显的差异.优化后CTAB法提取...     

贺兰山紫蘑菇基因组DNA提取方法研究

[目的]研究适合于贺兰山紫蘑菇（Corinarius rufo-olivaceus）基因组DNA的提取方法。[方法]通过采用改良CTAB法Ⅰ、改良CTAB法Ⅱ、SDS法、Doyle-Doyle法和KI法5种基因组DNA提取方法,分别提取贺兰山紫蘑菇的基因组DNA,用DU800核酸蛋白检测仪测定其DNA含量、浓度和纯度,并通过琼脂糖凝胶电泳进行提取结果比较。[结果]5种不同的提取方法均能提取该紫蘑菇的基因组DNA,其中KI法提取的DNA纯度、浓度和得率为最好。[结论]KI法是贺兰山紫蘑菇（C.rufo-olivaceus）DNA提取的适宜方法,该法具有简单、便捷、省时、适合基因组DNA大量提取的特点。     

4种镰刀菌基因组DNA提取方法的比较研究

[目的]寻找一种简便、高效的基因组DNA提取方法,为进一步开展镰刀菌等丝状真菌的分子生物学研究提供科学基础。[方法]采用改良的CTABS、DS、高盐沉淀和SDS-CTAB 4种方法提取8个镰刀菌菌株的基因组DNA,并对其进行质量测定及PCR分析,比较不同提取方法的效果。[结果]4种提取方法均可提取到基因组DNA,其抽提质量优劣依次为SDS、SDS-CTAB法、高盐沉淀法和CTAB法。其中采用SDS法可成功提取到所有供试菌株基因组DNA,而且DNA浓度和纯度均较高,RNA及其他杂质污染少。而高盐沉淀法和CTAB法提取到的基因组DNA不够完整或浓度较低。[结论]SDS法更适合于镰刀菌等丝状真菌基因组DNA的提取。     

一种简便实用的玉米干种子基因组DNA提取方法

利用改良的CTAB法提取玉米干种子基因组DNA,DNA样品经紫外光谱吸收、琼脂糖凝胶电泳、PCR和酶切检测,表明获得的DNA样品纯度较好、无明显降解,DNA质量可满足下游分子生物学实验要求,证实该方法是提取玉米基因组DNA的一种有效方法.     

苹果轮纹病菌DNA提取方法的比较

采用尿素提取法、氯化苄提取法以及SDS-CTAB提取法对苹果轮纹病菌的基因组DNA进行了提取和比较.结果表明,3种方法均能提取到苹果轮纹病菌的基因组DNA.其中,SDS-CTAB法效率最高,提取的DNA质量最好,但是耗时较长;尿素提取法操作简单快速,但是提取的DNA质量较低;氯化苄提取法提取的DNA纯度最低,蛋白质污染严重.将所提取的DNA经ITS试验检测与电泳检测,证明3种方法提取的DNA扩增效果良好,均可满足该真菌rDNAITS分析的要求.     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp,其完整开放阅读框为762bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具...     

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取,采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)范围是6.25~50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00~100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明,乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1,乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.     

4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究

【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.