中华绒螯蟹肝胰腺白化症的病因研究

2002年10月以来,通过逐户访问及调查问卷的形式对2001～2002年东太湖中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)养殖区"白膏症"发病症状、扣蟹的来源、投饵模式、水草覆盖率、螺蛳投入量、底泥状况、回捕率、产量等进行较为系统的调查。同时对病蟹进行寄生虫检查、病原微生物分离、回接攻毒及病变组织的电镜观察等病原学研究,结果未发现致病性生物。调查结果表明,中华绒螯蟹"白膏症"的发病率雄蟹显著高于雌蟹,其症状为甲壳发黄,头胸甲腹面下肝区发白色或青黑色,肝胰腺由正常的橘黄色变成淡黄或白色;症状严重的病蟹胸腔积水,肌肉松驰萎缩,肝胰腺呈糜烂状,鳃丝发黑。调查结果显示,"白膏症"的发生与饵料的投喂量、动植物饵料之比及水环境有着密切的联系。根据该病的主要症状及发病原因,认为该病应命名为中华绒螯蟹肝胰腺白化症。     

中华绒螯蟹肝胰腺白化症组织病理变化

采用常规石蜡切片技术和透射电镜技术,对患有肝胰腺白化症的中华绒螯蟹病变组织和细胞进行观察。发现病蟹肝胰腺、鳃、肌肉等组织细胞发生了不同程度的病变,其病理特征为肝细胞水肿、变性、坏死,细胞中脂肪颗粒锐减,线粒体水肿、嵴消失、形成空泡,内质网、溶酶体解体成小泡。鳃组织增厚,上皮细胞微绒毛排列疏松、不规则,部分线粒体嵴消失,出现膜性退化。坏死的肝细胞和鳃上皮细胞中出现细菌颗粒。肌细胞的病变主要表现为细胞核固缩,肌丝松驰、水肿、断裂、肌质网溶解形成小泡。中华绒螯蟹具有重要生理功能的肝胰腺、鳃组织发生了严重病变,使其功能损伤,不耐运输;而肌肉的松驰、肝胰腺脂肪的锐减影响了中华绒螯蟹的品质。同时,病变组织和细胞中未见病毒等生物病原,表明该病为非生物性疾病。图2表0参12     

饥饿对中华绒螯蟹卵巢快速发育阶段的脂类与肝胰腺脂类的影响

在中华绒螯蟹卵巢快速发育阶段（9-12月初），经三个月饥饿后，卵巢指数从平均3．23增加到8．19，卵巢总脂含量略有增加，绝对脂肪含量每只蟹从开始的191mg增加到513mg。但饥饿后的卵巢与正常的成熟卵巢指数及脂肪含量相比，显著降低，这说明饥饿较大影响了卵巢的正常发育和成熟；肝胰腺指数从5．85～7．48降为0．75～4．13，其绝对含量也显著降低，每只蟹平均降低1270mg，大大高于卵巢在饥饿时增加积累的脂肪，说明肝胰腺的脂肪除了转运到发育的卵巢中去以外，大部分脂肪应作为能量被消耗。饥饿期间卵巢对来源于肝胰腺长链多不饱和脂肪酸，尤其C20：5和C20：4优先选择利用，暗示这些脂肪酸是卵巢发育必需的脂肪酸，但对来源于肝胰腺的C18：3利用最低，显示C18：3不是卵巢发育的必需脂肪酸。     

中华绒螯蟹蜕皮周期中肝胰腺细胞组成的变化

取一年生未成熟中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)幼蟹, 甲壳宽度在15~40 mm, 暂养在75 cm×50 cm×45 cm的玻璃缸内, 24 h充气, 自然光照, 每天换水1/3, 每次换水后投喂土豆、杂鱼等食物, 动物适应实验室条件1周后进行实验。为得到蜕皮后的样本, 将处于蜕皮前晚期的个体在相同条件下单独饲养。根据已报道方法, 将中华绒螯蟹的蜕皮周期分为蜕皮间期C期、蜕皮前D₀、D₁和D_3–4期、蜕皮后A-B期等5个时期。采用细胞学和组织学方法观察中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺细胞组成的变化, 结果显示, R细胞数量在蜕皮间期和蜕皮前期都占绝对优势, 虽然在蜕皮前早期D₀期数量显著下降(P<0.05), 但从D₁期开始上升, 于蜕皮前晚期D_3–4期达到最高(62.06 ± 3.92)%, 而在蜕皮后A-B期又显著降低(P<0.05)。F细胞的数量除在D₁期显著增加外(P<0.05), 其余时期的变化无统计学差异(P>0.05)。B细胞数量在蜕皮前早期D₀期显著增高(P<0.05), 随后开始下降, 直到蜕皮前晚期D_3–4期恢复到间期水平, 而蜕皮后A-B期数量又显著增高(P<0.05)。E细胞数量除在蜕皮前早期D₀期稍微上升外, 其余时期基本稳定(P>0.05)。饥饿对处于不同蜕皮时期的中华绒螯蟹肝胰腺细胞组成的影响不同, 饥饿48 h后, 处于D₀时期的中华绒螯蟹与正常组相比, 肝胰腺R细胞数量无显著变化, B细胞和E细胞数量显著下降, F细胞数量上升。处于D₁时期的中华绒螯蟹与正常组相比, 肝胰腺R细胞、B细胞、F细胞和E细胞数量均无显著变化。说明中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺细胞组成的变化和蜕皮周期密切相关。本研究通过探讨中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺组织结构及细胞组成变化, 了解甲壳动物蜕皮过程的基础生物学现象, 并为其健康养殖提供理论基础。

     

中华绒螯蟹“六月黄”与成蟹肝胰腺营养成分比较

对同一年度、同一饲养环境下的中华绒螯蟹"六月黄"和后期成蟹雌、雄个体肝胰腺组织的营养成分进行了测定和比较分析。结果显示,"六月黄"的肥满度与雌性成蟹间没有显著性差异(P0.05),但肝胰腺指数极显著高于成蟹(P0.01)。"六月黄"肝胰腺中水分和灰分的含量极显著高于成蟹(P0.01),而粗脂肪含量极显著低于成蟹(P0.01),两种蟹的粗蛋白质含量没有显著差异(P0.05)。在检测到的17种氨基酸中,除"六月黄"雄蟹肝胰腺中丙氨酸的含量显著低于其雌蟹及雌、雄成蟹外(P0.05),其他16种氨基酸在"六月黄"与成蟹间均不存在显著差异(P0.05)。"六月黄"和成蟹的肝胰腺中含量最高的4种脂肪酸均为C18:1n9c、C18:2n6c、C16:0和C16:1,其总和分别占"六月黄"和成蟹肝胰腺中总脂肪酸的72.13%和69.02%(雌、雄蟹平均值)。"六月黄"的饱和脂肪酸总量显著低于成蟹(P0.05),但其单不饱和脂肪酸总量(ΣMUFA)和多不饱和脂肪酸总量(ΣPUFA)均显著高于成蟹(P0.05)。"六月黄"肝胰腺中Σn-6 PUFA的含量也极显著高于成蟹(P0.01),而Σn-3 PUFA含量二者不存在显著差异,因此"六月黄"的Σn-6/Σn-3 PUFA比率(1.42～1.44)低于成蟹(0.85～0.92)。结果表明,从总体上看,"六月黄"的营养价值较高,其肝胰腺的营养品质好于成蟹,"六月黄"养殖具有一定的产业发展前景。     

早熟期间中华绒螯蟹肝胰腺指数、肝脂含量及脂肪酸组成的变化

实验采用称量法和气相色谱法分别测定了性早熟前后中华绒螯蟹的肝胰腺指数(HI)、肝脂含量(LC)和肝胰腺脂肪酸组成。雌雄蟹的HI和LC在早熟前后的变化趋势一致,都是早熟个体低于未成熟个体。在性早熟前,雌雄蟹的肝胰腺脂肪酸组成基本一致,只是雌蟹中C20∶5n-3较高(P<0.05)。然而,对早熟前后的个体作比较时,发现雌雄蟹变化情况有很大差异:(1)早熟雌蟹中C16∶1n-7、C16∶0和C18∶0高于未成熟雌蟹(P<0.01),而C20∶5n-3、C20∶4n-6和C22∶6n-3则低于后者(P<0.01);(2)早熟雄蟹中C18∶1高于未成熟雄蟹(P<0.05),而C14∶0(P<0.05)、C16∶1n-7(P<0.05)和C20∶5n-3(P<0.01)皆低于后者。以上结果表明:雌雄蟹在性早熟前后存在肝胰腺脂肪酸组成变化的差异,且C20∶5n-3可能主要参与成熟蜕壳和膜的构建,而C22∶6n-3可能主要参与卵巢发育和卵黄的发生。     

中华绒螯蟹幼蟹蜕皮周期中肝胰腺和肌肉脂类的动态变化

以越冬后即将进入蜕皮的中华绒螯蟹幼蟹为实验对象,采用生化分析方法,研究其蜕皮周期肝胰腺及肌肉脂类的动态变化。本实验将其幼蟹蜕皮周期分为蜕皮前期(D期)、蜕皮期(E期)、蜕皮后期(AB期)和蜕皮间期(C1期和C2期)。结果发现,(1)蜕皮各期肝胰腺总脂含量变化显著,呈现为"高-低-高"的趋势,其中D期最高,AB期最低,C1、C2期开始回升;而肌肉总脂含量变化趋势与肝胰腺相反,为先上升后再下降趋势,在D期最低,AB期含量最高。(2)肝胰腺脂类中以甘油三酰(TG)为主,其次是磷脂(PL);而肌肉脂类主要是PL,其次是TG和胆固醇(CHO)。肝胰腺中TG含量为先下降后上升趋势,其中C1期含量最低,肝胰腺中的PL含量变化趋势与TC相反,AB期含量最高;肌肉中TG含量在E期最高,而此期的PL含量最低。(3)肝胰腺和肌肉的主要脂肪酸为C16∶0、C18∶1n9、C18∶1n7、C18∶2n6(LOA)、C20∶5n3(EPA)和C22∶6n3(DHA)(相对含量4%)。蜕皮周期内,肝胰腺中的饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和高度不饱和脂肪酸(HUFA)均表现为下降趋势,其中D期肝胰腺中的DHA和EPA含量最高;肌肉中的SFA和MUFA呈现为先上升后下降趋势,而肌肉中的PUFA和HUFA表现为先下降后上升趋势。研究表明,中华绒螯蟹幼蟹蜕皮周期中,肝胰腺和肌肉中的脂类成分发生了显著变化,肝胰腺中脂类可能是其蜕皮期间的主要能量来源物质之一。     

中华绒螯蟹血淋巴和肝胰腺的总蛋白含量与性早熟的关系

中华绒螯蟹扣蟹性腺发育与肝胰腺和血淋巴的蛋白质浓度相关.性早熟前后,雌雄扣蟹肝胰腺总蛋白浓度分别由(121.17±44.50)mg@g-1和(89.43±21.86)mg@g-1下降至(81.08±5.84)mg@g-1和(70.58±9.90)mg@g-1,雌性扣蟹的肝胰腺占体重的比值也由8.18%降至3.90%.血淋巴总蛋白浓度正常发育的雌性扣蟹为(99.55±12.06)mg@mL-1,明显高于性早熟雌性扣蟹的(72.26±17.87)mg@mL-1;而雄性扣蟹性早熟前后的血淋巴总蛋白浓度无显著差异.肝胰腺总蛋白浓度二秋龄雌蟹高于性早熟雌性扣蟹,但它们之间的血淋巴总蛋白浓度没有显著差异.二秋龄雄蟹的血淋巴和肝胰腺总蛋白浓度与性早熟雄性扣蟹相当,差异不显著.     

饥饿对中华绒螯蟹卵巢快速发育阶段的脂类与肝胰腺脂类的影响

在中华绒螯蟹卵巢快速发育阶段(9-12月初),经三个月饥饿后,卵巢指数从平均3.23增加到8.19,卵巢总脂含量略有增加,绝对脂肪含量每只蟹从开始的191 mg增加到513 mg.但饥饿后的卵巢与正常的成熟卵巢指数及脂肪含量相比,显著降低,这说明饥饿较大影响了卵巢的正常发育和成熟;肝胰腺指数从5.85～7.48降为0.75～4.13,其绝对含量也显著降低,每只蟹平均降低1 270 mg,大大高于卵巢在饥饿时增加积累的脂肪,说明肝胰腺的脂肪除了转运到发育的卵巢中去以外,大部分脂肪应作为能量被消耗.饥饿期间卵巢对来源于肝胰腺长链多不饱和脂肪酸,尤其C20:5 和 C20: 4 优先选择利用,暗示这些脂肪酸是卵巢发育必需的脂肪酸,但对来源于肝胰腺的C18:3利用最低,显示C18:3不是卵巢发育的必需脂肪酸.     

中华绒螯蟹的同属种类及其英文名称

余述绒螯蟹属中三个公认种的主要特征和地理分布,并对中华绒螯蟹目前使用的几个英文名称的合理性和取舍问题加以讨论。     

中华绒螯蟹肌肉抑制素基因(MSTN)同义突变对基因转录和翻译效率的影响

为分析同义突变对基因转录和翻译的影响,实验应用定点突变、体外转录和过表达等技术对中华绒螯蟹肌肉抑制素基因(Es-MSTN)中发现的5个SNP同义突变位点即SNP1(C/T)、SNP2(C/T)、SNP3(C/T)、SNP4(A/G)和SNP5(T/G),及其对应的12种基因型组合(CG、TA、1T、2T、3T、4A、5T、1C、2C、3C、4G和5G)进行了转录和翻译水平的研究。结果显示,12种基因型在体外转录中存在转录效率差异,1C基因型的转录水平最高,而CG和TA基因型的转录水平最低,差异显著;且TA基因型转录水平显著高于CG基因型。对上述基因型在293T细胞中进行过表达研究发现,不同突变基因型在转染后的不同时间(24、36、48、60、72、84、96和108 h)的表达强度存在显著差异,且TA突变基因型的表达强度显著高于CG突变基因型。研究表明,5个同义突变位点对中华绒螯蟹Es-MSTN的转录和翻译具有重要影响,同义突变也可能具有较为重要的生物学意义。     

低聚壳聚糖对中华绒螯蟹生长性能、体成分、非特异性免疫及抗氧化能力的影响

为研究低聚壳聚糖对中华绒螯蟹生长性能、体成分、非特异性免疫及抗氧化能力的影响,实验选用个体均匀、初始均重为(16.20±1.30) g的中华绒螯蟹288只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复12只,分别饲喂在基础日粮中添加0 (对照组)、25、50和100 mg/kg低聚壳聚糖的实验日粮,正式实验为期56 d。结果显示,与对照组相比,50和100 mg/kg低聚壳聚糖组中华绒螯蟹的饲料系数显著降低,可食内脏指数显著提高;50 mg/kg低聚壳聚糖组降低了中华绒螯蟹肌肉和可食内脏中粗脂肪含量,提高了蟹肌肉和可食内脏中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性;与对照组相比,50 mg/kg低聚壳聚糖组中华绒螯蟹碱性磷酸酶和酚氧化酶的活性显著提高。研究表明,添加低聚壳聚糖能够提高中华绒螯蟹生长性能、非特异性免疫和抗氧化能力,降低机体脂肪沉积,且添加量为50 mg/kg时效果较好。     

中华绒螯蟹幼体的栖息生境选择与行为特征

为探究中华绒螯蟹在早期发育阶段对不同栖息生境的选择偏好及其行为特征，实验以长江口近岸微生境类型为基础，在室内建立了藨草、泥底、铁板沙、砾石等4种模拟生境，选取中华绒螯蟹大眼幼体、Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ期仔蟹分别开展了对不同生境选择的行为观察和定量分析。结果显示，中华绒螯蟹大眼幼体、Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ期仔蟹在藨草生境中分布比例最高，显著高于其他三种生境。随着仔蟹的生长发育，Ⅲ、Ⅴ期仔蟹在泥底和铁板沙生境中占比增大。在藨草生境中，中华绒螯蟹幼体具有游泳、附着藨草、表栖、埋栖等4种行为，大眼幼体和Ⅰ期仔蟹主要表现为附着藨草行为，Ⅲ期仔蟹的表栖、埋栖行为显著增加。幼体在藨草生境中的蜕壳率显著高于泥生境，而死亡率显著低于泥生境。研究表明，中华绒螯蟹幼体偏好栖息于有利于其生存、发育的藨草等植被生境中，这可能与藨草等植被生境为中华绒螯蟹幼体提供了适宜的庇护场所有关。本研究结果指出了植被生境对中华绒螯蟹幼体阶段的重要性，丰富了早期生活史资料，并为其资源保护和栖息地生态修复提供了基础参考。     

中华绒螯蟹雌性亲蟹血淋巴生化指标与盐度的关系

设定淡水对照组和两个盐度组(盐度12,盐度25),分别在第0、3、6、12、24、48、72、96、144小时取样,研究盐度对中华绒螯蟹雌性亲蟹6项血淋巴生化指标的影响。结果表明,在0~144 h内,盐度组中华绒螯蟹雌性亲蟹血淋巴总蛋白(TP)含量在前6 h显著高于对照组(P<0.05),96 h后高低盐度组TP水平趋于一致,并保持在略高于对照组的稳定水平。葡萄糖(GLU)含量随盐度的升高而增大,盐度组GLU均呈先升高后降低趋势,盐度25组GLU在72 h达到最大值且显著高于盐度12组和对照组(P<0.05)。盐度12组甘油三酯(TG)含量呈降低趋势且在6~144 h显著低于对照组(P<0.05),72 h后显著低于盐度25组(P<0.05),盐度25组TG呈先下降后上升趋势,且在72 h后恢复至对照水平。盐度组碱性磷酸酶(ALP)活性呈先升高后降低趋势,盐度组乳酸脱氢酶(LDH)活性均在3 h达到最大值,12 h取得最小值。分析认为,中华绒螯蟹雌性亲蟹由淡水进入咸水,其血淋巴TP、GLU、TG含量均发生显著性变化,推测其机体加强能量代谢,加速动用脂类和糖类作为能源物质以应对盐度突变刺激;并最先调节蛋白质代谢过程以响应外界坏境的渗透压变化进行渗透压调节,其机体最终能够适应外界较高盐度的水体。     

中华绒螯蟹类浮舰蛋白基因Esflol的克隆和组织表达分析

甲壳动物高血糖激素家族目前仅被发现存在于节肢动物中,在血糖水平调节、蜕皮、应激反应等多种生理代谢活动中发挥着重要的作用。为了解这个家族中的重要一员--甲壳动物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone, CHH)如何调节河蟹体内的血糖水平,我们前期进行了转录组和表达谱分析,最终选取Esflol(Eriocheir sinensis flotillin-1 like,Esflol)作为我们的研究对象。根据转录组数据提示,结合RACE方法首次从中华绒螯蟹肝胰腺组织中克隆得到Esflol基因并进行了序列及组织表达分析。结果显示Esflol基因开放阅读框(ORF)1281bp,编码426个氨基酸,具有典型的SPFH超家族和PHB结构域,不含信号肽序列。多重序列比对分析表明,Esflol氨基酸序列与中华绒螯蟹flotillin-1相似度最高,达到57%。荧光定量PCR结果显示成熟中华绒螯蟹Esflol基因在肝胰腺组织中的表达量最高,其次为肌肉,另外在心,鳃,肠,胸神经节和胃中均有一定量表达,在脑中表达量较低。上述实验结果为下一步继续研究中华绒螯蟹糖代谢的生理机制奠定了基础,也为其他养殖类甲壳动物糖类代谢的研究提供了重要参考。     

中华绒螯蟹血细胞数及离体后形态学变化

中华绒螯蟹循环血液中血细胞总数为(13357±7196) cells·mm^-3,其中大颗粒细胞所占(49.8±7.5)%,其长轴(16.6±1.1) μm,短轴(10.2±0.6) μm;大小颗粒中间型细胞所占比例(20.6±5.3)%,其长轴(13.1±1.2) μm,短轴(8.4±0.5) μm;小颗粒细 胞所占比例(29.3±4.8)%,其长轴(12.4±1.2) μm,短轴(8.1±0.4) μm;无颗粒细胞所占比例(0.2±0.2)%,其长轴(11.3±1.3) μm,短轴(8.9±1.1) μm。血液离体后,在血液完全凝固的(97.7±25.3) s时间内,只有无颗粒细胞和小颗粒细胞形态结构发生变化,细胞及其胞核立即膨大,核质比迅速增大,细胞膜破损崩解,胞浆溢出,血液完全凝固后这些细胞形态结构继续变化,主要表现为胞质内线粒体、内质网等细胞器扩张溶解消失,小颗粒细胞中的小颗粒内含物渗出或溢出,颗粒空泡化或崩解,细胞核固缩等变化过程 。而大小颗粒中间型细胞和大颗粒细胞形态结构的变化明显慢于前两种血细胞,在细胞离体后5 min时,细胞和细胞核才开始出现膨大,并逐渐出现细胞膜、线粒体、内质网溶解消失,颗粒空泡化或崩解以及细胞核固缩等形态结构的变化。从血液离体后血细胞形态结构随时间变化的特点,推测无颗粒细胞和小颗粒细胞可能类似于脊椎动物的血小板,通过释放胞内凝血物质参与血凝的级联反应。     

中华绒螯蟹铁蛋白基因的克隆及表达分析

铁蛋白普遍存在于生物体内,具有铁离子解毒和储存等功能。在构建脂多糖刺激的中华绒螯蟹cDNA文库的基础上,获得了中华绒螯蟹铁蛋白基因EsFer的cDNA序列,其全长为1 118 bp,包含480 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为159氨基酸,其5′ 和3′ 端的非编码区分别为178 bp和461 bp,预测的分子量为18.3 ku,理论等电点为5.81,在15~37 aa处有一个跨膜螺旋。在5′ 非编码区核甘酸序列的135~162的位置有个特殊的结构,即铁反应元件(iron response element,IRE)。通过荧光定量PCR的方法研究了铁蛋白基因在中华绒螯蟹的组织表达分布,以及经脂多糖刺激后在血淋巴、肠和肝胰腺组织中的表达变化,发现EsFer在中华绒螯蟹血淋巴、肌肉、肠、鳃、心脏、性腺、肝胰腺等组织器官中都有表达,在肝胰腺的表达量最高,血淋巴中表达量最低。经脂多糖诱导后EsFer在血淋巴、肠和肝胰腺呈上调表达。