家蚕G蛋白α亚基基因BmGα73B原核表达及其表达条件优化

通过RT-PCR技术从家蚕中扩增出G蛋白α亚基基因BmGα73B的cDNA,克隆至原核表达载体pET-41b(+)中,所获得的重组质粒经酶切鉴定后,将其转化至E coli BL21诱导表达,用SDS-PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 158 bp的蛋白基因,诱导表达重组质粒pET-41b(+)-Gα73B,经SDS-PAGE检测,IPTGr的终浓度为1 mmol/L时,诱导4 h时蛋白表达量最高,出现分子质量约为73 kD的目的蛋白带,与蛋白的理论值相符。经Western blot检测,表达产物可与GST发生特异性反应。     

家蚕G蛋白诅亚基（BmGγ1）的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子，参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制，运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基（Gγ1）的序列，设计引物验证预测序列后，克隆了家蚕Gγ1的序列，再通过酶切克隆至表达载体pET-41b（＋）后，导入E．coli BL21宿主菌中，经异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶（glutathione s-transferase，GST）融合蛋白，并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析，在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白，说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因，并在E．coli BL21中高效表达。     

梅花鹿促卵泡激素α亚基基因克隆与融合表达

以原构建的克隆载体为模板,PCR扩增梅花鹿FSHα亚基基因,TA克隆后经双酶切插入表达载体pGEX-6P-2,阳性克隆导入E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-FSHα融合蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果表明,FSHα PCR产物大小约380 bp,测序结果与GenBank序列一致;重组表达载体pGEX-6P-2-FSHα构建成功;融合蛋白经SDS-PAGE分析,结果发现,在分子质量39.3 ku处出现特异性蛋白质条带,说明梅花鹿FSHα亚基基因片段已在E.coli BL21中成功表达了FSHα-GST融合蛋白。     

家蚕G蛋白γ亚基BmGγ30A的克隆及其原核表达

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究G蛋白在家蚕中的生理功能及其作用机理,运用生物信息学方法预测到家蚕Gγ的一段序列,通过设计特异性引物、PCR和RACE技术,克隆得到家蚕Gγ30A的序列。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+),并导入E.coli BI21宿主菌中进行诱导表达。家蚕Gγ30A重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子量约38 KDa处,出现特异性蛋白条带,表达方式分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达;试验结果说明我们已成功克隆到家蚕Gγ30A基因(GeneBank登录号:HQ699664),并在E.coli BL21中高效表达。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

布鲁菌外膜蛋白Omp22基因的原核表达与生物信息学分析

克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达,Western blot鉴定诱导融合蛋白。结果表明,成功克隆Omp22基因,构建pET-28a-Omp22原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达Omp22基因。DNA Man和BIOEDIT软件生物性息学分析Omp22融合蛋白二级结构中α-螺旋占22.17%;伸展链占19.81%;β-折叠占2.83%;无规卷曲占55.19%。说明该蛋白具有较高亲水性。     

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。     

猪雌激素受体α基因E区部分cDNA克隆与原核表达

采用逆转录PCR（RT-PCR）法从梅山猪子宫组织中扩增雌激素受体α（ERα）基因E区部分cDNA编码区546bp，并将其重组于谷胱甘肽转移酶（GST）融合表达质粒pGEX-6p-1中，经酶切、序列鉴定分析后，用该重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生GST-ERαE融合蛋白，分子量约为49ku，净灰度扫描融合蛋白占重组菌蛋白32％，结果表明成功构建GST—ERαE融合蛋白表达载体，并获得高效表达，为下阶段深入开展ERα蛋白功能研究打下了良好的基础。     

桑树黄化型萎缩病植原体溶血素基因MDPH的克隆及生物信息学分析和原核表达

溶血素为细菌分泌的能够使细胞溶解的毒素,是病原菌重要的毒力因子。利用同源克隆技术得到桑树黄化型萎缩病植原体溶血素全长基因,命名为MDPH(GenBank登录号:HQ891118)。MDPH全长717 bp,编码238个氨基酸,预测蛋白质分子质量为27.3 kD,等电点为9.29,氨基酸序列与其它植原体中已分离的溶血素有很高的同源性。蛋白质序列结构预测表明:MDPH的二级结构中富含α-螺旋,其次为β-折叠和无规卷曲,而β-转角仅占5.46%。对蛋白质序列的理化特征预测表明:MDPH有多个亲水和疏水区域,且疏水性强于亲水性;易形成跨膜螺旋,具有7个显著跨膜结构区;蛋白的抗原性较强,不含有明显的信号肽序列,为非经典分泌蛋白。将MDPH的编码区插入原核表达载体pET30a(+),并转化到E.coli BL21中,经过IPTG诱导,MDPH在BL21菌株中成功表达。研究结果为深入探讨MDPH的功能及植原体的致病机制奠定了基础。     

家蚕G蛋白γ1亚基(BmGγ1)的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制,运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基(Gγ1)的序列,设计引物验证预测序列后,克隆了家蚕Gγ1的序列,再通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+)后,导入E.coliBL21宿主菌中,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶(glutathione s-transferase,GST)融合蛋白,并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因,并在E.coliBL21中高效表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白分段表达及其生物学功能的鉴定

为进一步研究PRRSV GP5蛋白的生物学功能,本研究将已分离的PRRSV北美洲型野毒株TA-12的GP5基因分为4段(79 bp～207bp、133bp～330bp、229bp～492bp和382bp～603bp)分别克隆于pGEX-6p-1中,并转化E.coli BL21(Rosetta)细胞进行诱导表达.表达蛋白经纯化后,以间接荧光方法(IFA)检测它们与Marc-145细胞的相互作用.IFA检测结果表明GST-GP5-1和GST-GP5-2融合蛋白均能够与Marc-145细胞结合,而且其结合位点在27aa～110aa区域.本实验为进一步研究GP5蛋白生物学功能提供试验依据.     

羊种布鲁氏菌Omp10基因的克隆及原核表达

根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础.     

猪戊型肝炎病毒ORF3基因的克隆与原核表达

为了表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行研究,采用RT-PCR方法扩增猪戊型肝炎病毒(SHEV)ORF3完整基因,将扩增产物插入pMD19-T载体,再亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了pET-32a(+)-ORF3表达载体,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,同时对诱导表达条件进行筛选,并用SDS-PAGE和免疫印迹等方法分析鉴定表达产物。结果表明,成功扩增到345bp的目的基因片段,表达载体pET-32a(+)-ORF3转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,成功表达了ORF3基因编码的蛋白,当IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为6h时,该基因在E.coli BL21(DE3)中表达量最高。表达产物的分子质量约为29.6ku,与预期目的蛋白分子质量相符。表达的蛋白既有包涵体形式,也有可溶性形式。经Western blot检测,表达的目的蛋白能与SHEV阳性血清发生特异性反应。     

猪补体C5a蛋白表达、纯化和生物学活性检测

参照NCBI中公布的猪补体C5a蛋白氨基酸序列及猪C5蛋白的全基因序列,通过生物信息学分析获得猪C5a蛋白基因全长,为222 bp,该序列定向插入原核表达载体p ET-28a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western-blotting检测分析表明,C5a基因获得表达,重组蛋白大小为10 000。利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化后,体外细胞试验测定重组C5a蛋白生物学活性。结果显示,成功构建了p ET-28a-C5a重组质粒,纯化获得目的蛋白纯度达到90%以上,质量浓度为2.5 g/L。细胞试验检测到C5a具有趋化和诱导中性粒细胞的活性。本研究为揭示猪C5a参与炎症过程的作用机制及制备C5a拮抗剂奠定了基础。     

噬菌体Bp7穿孔素holin的克隆、表达及其活性分析

为了研究噬菌体Bp7穿孔素holin的特征及其对细菌的抑制作用,根据噬菌体Bp7的基因序列,设计引物PCR扩增穿孔素holin基因,并对其序列进行比对和分析。构建holin原核重组表达质粒pCold-holin,在大肠杆菌BL21中诱导表达,摸索最佳表达条件。亲和层析法纯化蛋白质,并对其抑菌活性进行测定。结果表明,噬菌体Bp7的holin蛋白含有一个跨膜区,属于Phage-holin-T家族;在E.coli BL21表达的重组holin蛋白以可溶性形式存在。表达菌E.coli BL21浊度测定试验结果表明holin蛋白的表达在4h内能够显著抑制表达菌E.coli BL21的增殖,活菌数减少,菌体出现凝集现象。研究结果提示噬菌体Bp7的holin蛋白具有抑菌活性,这将为进一步研究穿孔素的抑菌机制奠定基础。     

北京鸭抑制素α-亚基免疫原的制备及活性研究

将重组有北京鸭抑制素α-亚基基因的T载体和pET-28a表达载体分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接并转化E. coli BL21(DE3),经PCR和双酶切鉴定,筛选得到阳性重组表达载体,在IPTG诱导下融合表达了北京鸭抑制素α-亚基蛋白。试验结果表明,抑制素α-亚基基因在E. coli BL21中得到了有效表达,表达产物具有免疫活性,为后期探讨该免疫原提高北京鸭产蛋性能的研究奠定基础。     

PADRE-TGFβ1融合蛋白的原核表达及鉴定

构建PADRE-TGFβ1原核表达质粒,并对其进行诱导表达和反应原性分析.对PADRE、联接序列(Linker)及TGFβ1的基因序列进行密码子优化,采用全基因合成的方法人工合成全长PADRE-Linker-TGFβ1序列,合成产物克隆至pET-28a(+)质粒.将构建好的质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受...     

大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表达及纯化

为表达和纯化SP-B蛋白,先对SP-B基因进行稀有密码子优化,PCR反应获得SP-B片段,构建重组质粒pGEX4T-1/SP-B,转化到E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用SDS-PAGE与Western blot进行检测;用GSTPrep FF 16/10对融合蛋白进行纯化。经双酶切鉴定证实质粒中插入基因长250bp,测序结果与大鼠SP-B cDNA序列相符;质粒转化后用IPTG进行诱导,在分子质量约34ku处出现1个新条带,与pGEX4T-1/SP-B蛋白预期大小一致,且该融合蛋白能可溶性表达并被纯化。结果表明成功构建了pGEX4T-1/SP-B重组质粒,表达、纯化得到GST/SP-B蛋白,为研究肺表面活性物质替代药物奠定了基础。