利用与su1紧密连锁的Ac转座子构建玉米插入突变体库

以位于玉米第4号染色体短臂与su1紧密连锁的Ac转座子作为Ac供体,结合w22报道系,创建1 507个Ac远距离转座事件。利用基于Southern Blot的IPCR和基于酶切连接的Genome-Walking PCR方法,分离到其中56个独立的可遗传Ac/Ds(transposed Ac/Ds,tr-Ac/Ds)侧翼序列标签,补充了Ac/Ds转座插入突变体的数量。利用玉米B73的基因组序列,通过BLAST比对分析将trAc/Ds定位到了玉米基因组上,并分析了Ac/Ds插入位点附近DNA序列,其中51个tr-Ac/Ds插入序列为单拷贝序列,鉴定到39个trAc/Ds插入到了基因内部,12个Ac/Ds插入到基因间区域,进一步证明了Ac/Ds倾向于插入基因内部和低拷贝的基因组富集区。     

玉米Mutator转座子结构特征和基因克隆的研究进展

Mutator（Mu）转座子是已发现的植物中转座活性最强的转座子,其较高的转座频率以及趋向于插入单拷贝功能基因转座的特性,使其成为构建玉米突变体库的一个主要方法。当前玉米B73品系基因组测序已经基本完成,利用反向遗传学方法,研究玉米基因的功能更为方便。文中简要介绍Mu转座子的结构特征以及Mu的分类,介绍3种克隆Mu转座子标签插入位点侧翼序列的技术,对Mu研究所存在的问题进行分析,展望Mu的应用。     

玉米Mutator转座子的结构特征与作用性质

玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统3大类,其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围,引起的正向突变频率为10-4~10-5,比野生玉米高出近30倍,所引起的突变大部分为隐性突变。由转座子引起的突变,可以通过TAIL-PCR的方法对相关的突变基因进行克隆。本文主要对Mutator转座子的种类、结构特征和作用性质进行综述,并对Mutator转座子的研究应用进行展望。     

大豆转座子的研究现状及应用前景

大豆基因组中约有5万基因,大部分基因的功能处于未知状态。转座子插入突变体库的应用可以为解码大豆基因组中未知基因的功能提供研究平台,同时,也可以为创建有育种应用价值的大豆突变体种质资源库提供基础。大豆基因组中50%~60%的组分为转座子,其中具有活性的且结构完整的转座子只有Tgm9。大豆转座子突变体库目前主要还是利用外源转座子来建立,但是开发并改进内源转座子,增加其跳跃能力及稳定性,可以成为构建突变体库的一个新方向。本文主要介绍了大豆基因组中发现的各种转座子及其特点,并且重点讨论了外源转座子和大豆内源转座子在大豆突变体库创建中的应用现状及应用前景。     

转座子Ac/Ds的水稻转化及杂交后代中Ds的跳跃分析

摘要: 利用根癌农杆菌介导的转化法, 把双元表达载体CamDs（含有激活标签和基因捕获器结构）和含有玉米Ac转座酶的质粒(NeaAc)转入水稻。PCR结果表明Ac和Ds已整合到水稻的基因组中。转Ac植株与转Ds植株杂交,获得了12个杂交组合。杂交F1代水稻苗经过抗生素筛选,得到108株同时含有Ac和Ds因子的水稻苗。Basta抗性检测了Ds因子在杂交F1代中的跳跃情况,发现转座频率为13%。Ds空供体位点的PCR扩增结果与Basta抗性检测一致。另外,对跳动过的植株进行部分组织GUS染色表明Ds因子中的基因捕获器可以捕获到基因的表达。     

转座子标签法及其在大豆功能基因组研究中的应用前景

转座子标签法是克隆未知基因的有效方法之一.本文介绍了转座子标签法的基本原理、步骤、方法及其在植物基因克隆中的应用情况,并对该方法在大豆突变体库构建和功能基因组研究中的应用前景进行了讨论.     

我国第一个水稻T—DNA插入突变体库在中国水稻研究所建成

由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理生态研究所合作完成的“水稻Ｔ-ＤＮＡ插入突变体库的构建和研究”成果 ,于２００２年１２月２３日通过了由浙江省科技厅主持、以中国水稻基因组学著名专家李家洋院士和韩斌博士为主任委员的鉴定委员会的成果鉴定。鉴定委员会认为该项成果已达到国内领先水平 ,部分成果达到了国际水平。通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系 ,将玉米转座子Ａｃ／Ｄｓ等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织 ,获得了１．２万余个独立的Ｔ -ＤＮＡ插入株系 ,并构建…     

基于转座子突变获得苏云金芽胞杆菌解毒Cr(Ⅵ)的相关基因功能分析

为了获得苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)解毒Cr(Ⅵ)的相关基因并进行功能分析,从Bt407转座子随机突变体库筛选并获得了9株Cr(Ⅵ)还原能力突变株,测定了其转座子插入位点,并研究了表型变化。这些突变株的Cr(Ⅵ)还原能力比野生株极显著提高(p0.01),其转座子插入位点均为编码假定的肽链内切酶yddH基因。研究结果表明,野生株与突变株的生长曲线没有显著差异,说明突变株Cr(Ⅵ)还原能力的极显著提高与菌种数量改变无关。突变株总铬含量基本保持不变,表明Bt 407主要是通过将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)来解毒Cr(Ⅵ)。本研究为构建高效解毒Cr(Ⅵ)工程菌提供了新候选基因材料。     

木薯细菌性枯萎病菌转座子库的构建及其质量评价

为了研究木薯细菌性枯萎病菌的致病分子机理,本研究开展了病原菌的转化子库构建工作.采用电击法,将EZ::TN转座体转化野生型菌株.获得了总数为20 382个转化子并进行了质量评价,采用剪叶法从9 872个转化子中筛选出94个致病性变异的转化子.采用Tail-PCR获得了致病力丧失突变体Xtn62-36的侧翼序列,分析结果表明可能是外源片段插入预测基因AspCxam的编码区而造成致病力丧失.病原菌转化子库的构建及Tail-PCR技术的应用为进一步开展致病相关基因功能的研究提供了基础.     

甘蓝型油菜花序长发夹ｌｈＲＮＡｉ文库的构建

异源四倍体油菜含有大量多拷贝基因及冗余基因,难以通过T-DNA插入、物理及化学诱变等常规突变体库创制方法发掘功能基因。为开发适应于油菜的简单高效的突变体库创制方法,本研究通过滚环复制方法构建了甘蓝型油菜的花序lhRNAi文库,并对这种新型的干扰文库进行质量评估;然后将该花序lhRNAi文库对甘蓝型油菜进行遗传转化,获得763株T0植株,从中鉴定分离出74株具有可见表型变异的花发育相关突变体,包括花瓣减少、形状异常,柱头卷曲,雄蕊退化萎缩,雄性不育（不能产生花粉）、死蕾或花蕾闭合等。说明通过滚环复制介导的lihRNAi文库的构建方法可以成功应用到油菜中,这将为油菜花序发育相关基因功能的研究提供重要的研究平台。     

转座子标签法克隆水稻基因前景

转座子标签法克隆基因是近年来发展起来的一种非常有效的分子生物技术。介绍了转座子标签技术克隆基因的基本原理及研究进展,并对转座子标签技术在水稻基因克隆上的应用进行了讨论分析。     

应用克隆文库研究玉米根系AMF多样性方法的建立

以玉米根系为例,建立植物根系丛枝菌根18SrRNA基因克隆文库构建的方法。CTAB法提取的丛枝菌根真菌总DNA能够满足后续PCR扩增的要求。运用真菌引物GeoA2/Geo11及AMF特异引物AM1、AM2、AM3/NS31进行巢式PCR扩增,获得的产物连接转化入大肠杆菌构建18SrRNA部分基因克隆文库。通过限制性内切酶Hinf I、TaqI对随机挑选的50个克隆子进行ARDRA(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)分析,共获得11个差异图谱。每个图谱选择1个代表测序,结果表明,3个序列为玉米自身未知基因,其余8个都为Clomus属序列。文库评价统计结果发现,AMF克隆文库的Coverage值为72.4%,Rarefaction曲线趋于平缓,所建立文库的容量较为充足,能较全面地代表玉米根系AMF的多样性。     

一个新的玉米叶色突变体的遗传分析及基因定位

在玉米自交系81647中发现了一个叶色突变体,该突变体在苗期叶片表现出黄绿色,随后叶片上出现坏死斑,短时间内植株萎蔫死亡。遗传分析表明,该突变性状由1对隐性基因控制,命名为nec-t(necrotic-temporary)。以玉米自交系B73与nec-t突变体的F2分离群体作为定位群体,利用SSR标记将该基因定位在第2条染色体的K2和K14之间(SSR标记),其物理距离约为2.52 Mb。     

利用CRISPR-Cas9技术编辑ZmSh2基因创制超甜玉米新种质

选取玉米ZmSh2基因,利用CRISPR-Cas9技术构建基因编辑载体pBUE411-ZmSh2,以玉米C01未成熟的幼胚组织为受体,利用农杆菌介导法将目的基因转入到玉米幼胚中,以草铵膦为选择剂进行筛选获得ZmSh2基因编辑的突变体株系。通过表型观察发现,编辑的纯合突变体材料明显比对照玉米自交系C01褶皱,使用手持式糖度仪检测突变体植株的甜度可达到25%。结果表明,利用CRISPR-Cas9技术能够创制出超甜玉米新种质材料,为CRISPR-Cas9介导玉米其他性状定向遗传改良提供了重要的理论和实践依据。     

水稻雌性败育基因FA的图位克隆

目的 对水稻胚囊突变体的表型观察、遗传定位和基因克隆,将为研究植物生殖发育奠定理论基础。方法 从粳稻品种宁粳4号突变体库中筛选出一个雌性败育突变体female abortion(fa),对野生型和突变体不同发育时期的胚囊进行细胞学观察并统计胚囊类型。以突变体杂合型为母本,N22为父本构建定位群体,对该表型进行遗传分析,采用图位克隆方法精确定位目的基因。结果 表型分析显示,突变体雌蕊在外观上没有表现出差异,但成熟时植株完全不育。与野生型相比, 该突变体胚囊发育异常,不能形成七细胞八核胚囊结构,而且形成多种类型的异常胚囊。遗传分析表明,该突变性状受一对隐性核基因控制。我们将该基因初定位在第1染色体的分子标记L1和L3之间,通过扩大定位群体,最终将基因定位在分子标记L10和L11之间,物理距离为117 kb。测序分析发现该区间内LOC_{_}Os01g68870外显子上有一个单碱基替换,由胸腺嘧啶(T)替换成胞嘧啶(C),氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸,从而导致该表型的出现。qRT-PCR结果显示,相对于OsMADS13、OsAPC6、OsTDL1A基因在突变体fa胚囊中表达量而言,OsDEES1基因在突变体fa胚囊中表达量变化最为显著,FA可能是OsDEES1的上游基因。亚细胞定位结果显示,该蛋白定位于质膜。结论 FA是多孢囊基因MULTIPLE SPOROCYTE 1(MSP1)的新等位基因。本研究进一步明确了该基因对于水稻胚囊发育的重要性,可为探明它所在的调控网络体系提供新的线索。