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RT-PCR和实时荧光RT-PCR一步法检测大豆中菜豆荚斑驳病毒 总被引:1,自引:0,他引:1
针对进口大豆的菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)检测,建立了一步法RT-PCR和一步法实时荧光RT-PCR检测方法.依据BPMV的外壳蛋白编码基因设计了特异引物和特异Taqman探针,特异引物的扩增片段约为500bp,阳性质粒的实时荧光PCR方法的检测下限为20fg/μL,是一步法RT-PCR方法的100倍,检测时间由约8 h缩短至4 h.种脐灰色斑驳的大豆种子BPMV检测呈阳性,种脐黑色斑驳的大豆种子BPMV检测呈阴性. 相似文献
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半巢式RT-PCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究 总被引:7,自引:0,他引:7
菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)在美国东部和南部的大豆产区广泛分布。该病毒能够造成3%~52%的产量损失并使大豆品质降低,目前我国未见其分布。针对进口大豆种子的植物病毒检测,本文建立了半巢式RT-PCR技术检测BPMV的方法。该方法采用Trizol快速提取大豆种子病毒总RNA,并根据BPMV的外壳蛋白编码基因设计特异性引物,经第一轮RT-PCR和第二轮半巢式PCR扩增,分别得到275 bp和196 bp大小的特异性基因片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,该产物序列与BPMV的外壳蛋白编码基因存在91%~95%的高度同源性。检测灵敏度比较研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这2种方法高出103倍以上。 相似文献
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单管实时荧光RT PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究建立了大豆种子中菜豆荚斑驳病毒(BPMV)和烟草环斑病毒(TRSV)单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受两种病毒侵染的大豆种子作为待测样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性更强,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。 相似文献
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大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus(BSMV)是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(coat protein, CP)基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus(SBMV)、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus(WSMV)、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus(MCMV)、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus(TRSV)、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus(BPMV)和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus(ToRSV)6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。 相似文献
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进口大豆上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获巢式RT-PCR检测 总被引:4,自引:0,他引:4
利用DAS-ELISA对进口大豆上BPMV进行检测发现,从美国进口的部分大豆样品对BPMV的多抗血清呈阳性反应;利用免疫吸附电镜观察发现,ELISA检测阳性的大豆种皮病汁液中存在直径约30nm的球状病毒粒子.根据BPMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计了2对嵌合引物,建立了BPMV的高灵敏的免疫捕获巢式RT-PCR(IC-nested RT-PCR)检测方法.该方法经免疫捕获、反转录和2轮PCR扩增,能从带毒大豆种子中扩增到预期大小的DNA条带.序列测定与分析表明此条带的序列为BPMV部分CP基因,在系统关系树上与BPMV的其它分离物形成一簇亲缘关系很近.实验表明从进境大豆上检测到了BPMV. 相似文献
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以番茄环斑病毒阳性样品为研究材料,根据GeneBank(核酸序列数据库)中的序列设计特异性引物进行IC-RTP-CR(免疫反转录聚合酶链式反应,下同)扩增,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序后与目标序列(ToRSVL19655)比较,核苷酸同源性为87.3%。通过实验建立了检测该病毒的IC-RT-PCR方法。该方法对其他样品核酸提取困难而抗体较容易制备的病毒检测同样具有借鉴意义。 相似文献
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齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究 总被引:2,自引:0,他引:2
齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)与建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CyMV)是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明:普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100%的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。 相似文献
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番茄黑环病毒分子生物学检测方法及分离物序列分析 总被引:1,自引:1,他引:1
根据TBRV运动蛋白基因的保守序列设计引物,RT-PCR和IC-RT-PCR能从6个TBRV的分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带,序列测定和分析表明所测定的序列为TBRV运动蛋白基因的部分序列,在系统关系树上与TBRV的其它分离物形成一簇,表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。 相似文献
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