稻田土壤DNA的提取及nifA基因的PCR扩增

为弄清茅贡米土壤微生物群落结构和生物固氮等代谢活动机制,采用试剂盒、SDS高盐和土壤预处理+SDS高盐3种土壤DNA提取方法,以从贵州茅贡米基地采集的土样提取的宏基因组DNA为模板,进行nifA基因的PCR扩增,比较了3种土壤DNA提取方法的效果.结果表明,试剂盒提取的DNA扩增到约200 bp和900 bp的nifA...     

PCR法扩增钙激活酶激活蛋白cDNA

钙激活酶激活蛋白是钙激活酶的激活蛋白, 可以促进钙激活酶活性的发挥, 从而促进肉的嫩化。采用PCR技术, 以山羊肝脏cDNA为模板经扩增得到钙激活酶激活蛋白(calpainactivator) 基因, 并进行了序列测定。该片段长1 017bp, 5′—端非翻译区长39bp, 3′—端非翻译区长567bp。编码区长411bp, 编码一个长137个氨基酸残基的蛋白质, 其理论分子量为14 298Da。与EdonMelloni等(1998) 报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蛋白的氨基酸序列相比发现, 二者仅有五个位点不同。     

多重PCR检测猪源大肠杆菌毒素基因

根据猪源大肠杆菌产生的4种主要毒素(STa、STb、LT、SLT-2e)基因序列，设计4对聚合酶链式反应(PCR)引物，建立多重PCR方法。该方法能快速地检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和产志贺样毒素大肠杆菌(SLTEC)菌株，准确地了解所检测菌株产生肠毒素和志贺样毒素的情况。对215株猪源病原性大肠杆菌进行检测，其中STa为52．56％，STb为26．51％，STa STb为8．84％，STa STb SLT-2e为6．51％。这表明多重PCR可为猪源大肠杆菌毒素基因的检测提供一种更加快速、经济、易行的技术。     

苹果自交不亲和基因PCR扩增程序优化

通过研究PCR反应体系(DNA、Primer、Mg2+、dNTP、Taq聚合酶、buffer)及退火温度对苹果自交不亲和基因(S基因)扩增结果影响的分析,构建了适合于苹果自交不亲和基因的PCR扩增程序的优化体系。结果表明:在20μL的反应体系中,模板DNA的最适含量为40ng,dNTP最适浓度为0.25mmol/L,而Primer最适浓度为0.4μmol/L,Mg2+的最适浓度为2.5mmol/L,Taq聚合酶最适浓度为1U,buffer最适浓度为1×buffer,最适退火温度为50℃。     

一种基于模板DNA的PCR扩增难易预测方法

借助赋予四种碱基A,G,C,T四个三维空间中的点(0,0,1),(0,1,0),(-1,-1,0),(1,0,0),将一条DNA序列转化为一个二十四维向量。在此基础上利用Fisher线性判别法对人类基因组中189条基因片段进行PCR扩增难易预测,识别率达到了90%。     

番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS-PCR扩增条件的优化

探索一种简单、快速的获得番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS目的片断的方法。采用改良的Rodrigues组织培养表面消毒技术和CTAB法提取植物样品总DNA,利用真核生物通用引物LH2/Sm73扩增rDNA ITS目的片段,正交法优选ITS-PCR扩增条件。PCR反应可同时获得两条600 bp和700 bp产物,分别为植物和内生真菌的rDNA ITS目的片断。改良的组织表面消毒技术可排除外源DNA污染。正交法可快速获得植物内生真菌目的片断。该法简单、快速,为番荔枝科植物内生真菌生物多样性研究提供分子生物学基础。     

菊芋凝集素基因组片段的PCR扩增及克隆

通过PCR扩增 ,获得了菊芋凝集素基因 (hta)的编码区基因组片段hta - g。DNA序列分析表明 ,PCR产物长 70 2bp ,包括 444bp的编码区序列 ,编码区被一个 2 5 8bp的内含子分成 2个长度分别为 2 1 0bp及 2 34bp外显子 ,内含子边界序列符合GT/AG规则。与htacD NA序列的比较分析表明 ,hta - g的编码区序列与htacDNA序列高度同源 ,同源性在 93%～98%。     

SELEX技术中ssDNA文库PCR扩增条件的优化

[目的]对SELEX技术中ssDNA文库的PCR扩增条件进行优化。[方法]采用L16(45)正交试验设计在4个水平上对影响单链随机DNA文库PCR反应体系的Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶含量、引物浓度和随机单链DNA文库量5个重要因素进行了优化,同时对PCR反应的退火温度和循环次数进行了优化,确立最优反应体系和扩增程序。[结果]20μlPCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer2.0μl,随机ssDNA文库0.5ng,Mg2+2.5mmol/L,dNTP Mixture0.25mmol/L,上下游引物各0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5U;退火温度为68℃,最佳循环数为12。此反应系统下,随机ssDNA文库PCR扩增谱带清晰、稳定、特异性高。[结论]为SELEX技术中筛选到特异性更强的适配子奠定了基础。     

应用PCR技术扩增大肠杆菌热敏肠毒素基因

以一对合成的特异性寡核苷酸片段为引物，通过聚合物酶链反应，对不同血清型的ＥＴＥＣ以及１０４份件，猪及鸡源大肠杆菌分离中ＬＴ基因片段进行扩增。３株已知血清型ＥＴＥＣ，１３份牛源，６份鸡源，１０份猪源的大肠杆菌扩增后可见一条３１４ｂｐ的片段，而非ＥＴＥＣ大肠杆菌，沙门氏菌等扩增后未出现这一片段。     

热启动PCR扩增法诊断DMD基因缺失

采用热启动聚合酶链反应方法，对１０例杜氏肌营养不良症（ＤＭＤ）患者进行ＤＭＤ基因缺失检查。结果显示，７例病人都有ＤＭＤ基因ｅｘｏｎ４８缺失，说明ＤＭＤ基因缺的是ＤＭＤ发病的重要原因。     

木质素生物合成调控基因工程研究进展

木质素生物合成是植物体内比较复杂的生化过程,存在多基因、多条途径交互作用。基因工程调节植物木质素合成已成为国际上研究的热点。综述了转基因技术调控植物木质素生物合成的研究进展。提出创造低木质素含量和组分改变的优质新品种,对于造纸和纺织工业等的可持续发展具有重要的意义。     

伊犁马COMT基因第1外显子多态性及其与心率的关联性

【目的】 研究伊犁马COMT基因第1外显子的多态性及其构建的单倍型,并分析不同基因型、单倍型组合与心率之间的关联程度,为研究COMT基因对马匹气质及生产性能的影响奠定前期基础。【方法】以35匹伊犁马为研究对象,采用酚—氯仿法、DNA测序等技术分析COMT第1外显子基因多态性位点及基因型,通过haploview 4.2 软件构建单倍型,采集马匹心率,并对其与不同基因型、单倍型组合进行关联分析。【结果】伊犁马COMT基因第1外显子中共发现8个突变位点,其中SNP1、SNP2、SNP4、SNP5、SNP7和SNP8为错意突变;除SNP7与其余各突变间均无较强连锁外,SNP1-6、SNP8均存在一定的强连锁关系,SNP1和SNP4完全连锁;构建出9种单倍型,其中H1为优势单倍型;进行不同 SNPs位点及单倍型组合与心率的关联分析发现SNP3和SNP5不同基因型在温和刺激心率上存在显著或极显著性差异(P<0.01或P<0.05),SNP2、SNP5、SNP6、SNP7和SNP8不同基因型在剧烈刺激心率上均有显著或极显著性差异(P<0.01或P<0.05),单倍型组合H1H2在剧烈刺激心率上显著性大于H1H3。【结论】伊犁马COMT第1外显子上存在多态性,且不同突变间存在一定程度的强连锁,不同基因型、单倍型组合个体在心率上存在差异,提示COMT基因可能是对伊犁马气质和生产性能影响的重要功能基因。     

反义CCoAOMT基因调控烟草木质素的生物合成

[目的]研究木质素的生物合成及调控,降低木质素的含量或改变其组分。[方法]用农杆菌介导法将苎麻反义CCoAOMT基因导入烟草,采用PCR及Southern印迹对获得的转基因植株进行分子检测,并测定移栽3个月转基因植株Klason木质素及纤维素含量。[结果]转基因烟草与野生型对照相比木质素平均含量降低了16.8%,纤维素平均含量升高了15.2%,并且植株生长正常。[结论]抑制植物CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成的有效途径。     

木质素合成酶基因F5H的克隆及其鉴定

通过RT-PCR从正在分化的2年生欧美杨107号茎的次生木质部提取mRNA,扩增出一基因片段,与pGM-T载体连接,重组质粒经EcoRI酶切、特异性引物扩增、测序鉴定。结果表明,该基因片段长度为867bp,与EMBL核酸序列库中VanDoorsselaere等发表的白杨杂种F5H的cDNA序列(PAJ10324)相比,同源性高达99.19%,可以断定所扩增的DNA片段即为F5H基因片段。     

基于四段基因序列的野牡丹科植物PCR反应条件优化

为了建立植物分子系统学研究中常用的核基因的ITS,CHS和叶绿体基因的psbA-trnH,rpl16序列在野牡丹科植物中的PCR扩增反应的最佳反应体系,寻找最佳反应条件。采用改良的试剂盒法提取了15种野牡丹科植物的基因组DNA,进行了引物筛选,退火温度优化,添加牛血清蛋白(BSA)和二甲基亚砜(DMSO)的优化,反应体系正交设计一系列优化。并采用优化后的反应条件,对这4个基因片段在15种野牡丹科植物中进行PCR扩增验证。结果表明:优化后的反应条件在野牡丹科植物中具有较高的稳定性和良好的通用性。说明优化后的反应条件可以进行后续分子系统学研究。     

城市生活垃圾中木质素含量测定方法的优化

[目的]为更有效地处理生活垃圾提供参考。[方法]采用硫酸法测定生活垃圾中的木质素。以垃圾中脂肪抽提时间、硫酸浓度、水解反应温度、水解反应时间、加水稀释硫酸浓度、回流时间为考察因素进行6因素5水平正交试验。[结果]测定生活垃圾中木质素含量时各因素影响大小为：回流时间〉水解反应温度〉硫酸浓度〉脂肪抽提时间〉水解反应时间〉加水稀释硫酸浓度。测定生活垃圾中木质素含量的最佳条件为：脂肪抽提时间1h、硫酸浓度60%、水解反应温度20℃、水解反应时间1h、加水稀释硫酸浓度9%、回流时间3h。优化后木质素的测定条件RSD均小于1.51%,表明该方法的精度高,适用于垃圾填埋各个阶段的木质素含量测定,且分析结果准确可靠,符合分析方法的要求。[结论]优化了城市生活垃圾中木质素含量的测定方法。     

研究土壤微生物多样性的PCR条件优化(英文)

[目的]对PCR-DGGE法的试验条件进行优化,以更好地分析土壤微生物遗传多样性。[方法]改良高盐法提取土壤DNA,改进引物设计,改变PCR反应过程中退火温度、扩增体系,比较PCR扩增结果。[结果]经过改良的高盐法提取的土壤微生物DNA效果更好。PCR扩增选择20μl体系条带单一,易于操作。退火温度选择在55℃时无非特异性扩增,35个循环次数易于后续DGGE分析。[结论]已经优化的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

苏铁共生蓝细菌PCR条件的优化

在研究苏铁共生蓝细菌的种群多态性过程中 ,为了直接以极少量的新鲜蓝细菌为PCR反应模板 ,对 5种抗抑制剂进行了一系列优化组合方案的试验 ,并对比了 3种循环参数 ,发现在 2 5 μL标准反应液基础上加有 3.75 μL 10 %BSA和 2 μL 10 %DMSO ,退火温度为 5 6℃时效果最佳。     

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为提高梗丝的吸味品质、将梗丝木质素降解成小分子化合物,采用单因素试验和多因素试验相结合的方法研究酶解温度、酶解时间和漆酶用量对梗丝木质素降解效率的影响及酶解最适条件优化.结果表明:1)梗丝木质素的降解率随酶解温度的升高呈先升后降趋势,在62℃时降解率较高,为48.16％,与其他温度处理差异显著;2)随酶解时间的增长梗丝木质素的降解率呈上升趋势,在7h、8h和9h时降解率较高,三者均超过60％,与其他处理差异显著;3)随漆酶用量的增加梗丝木质素的降解率逐渐增大,在用量为0.55 μL/g和0.65 μL/g时降解率较高,分别为41.76％和46.80％,显著高于其他处理,但二者之间无显著差异.4)在酶解条件分别为62℃、8h、0.55 μL/g时,漆酶降解梗丝木质素的降解效果最好,降解率为66.52％.     

降烟秆木质素粗毛栓菌液态发酵工艺研究

为了提高降烟秆木质素粗毛栓菌(Trametes hirsuta)S13液态发酵生物量,获得菌龄整齐、特性稳定的菌丝体,采用正交设计及单因素分析技术优化了粗毛栓菌S13培养基及发酵条件。获得最佳培养基配方为:蔗糖20 g/L,玉米粉20 g/L,豆粕60g/L,K2HPO41.0 g/L,MgSO40.5 g/L,KCl 0.5 g/L;最佳发酵工艺参数为:初始pH 5.0,接种3块菌塞,500 m L三角瓶装液量80mL,180 r/min,30℃发酵5 d。在此发酵工艺条件下,粗毛栓菌S13液态发酵生物量得到显著提高,可达49.83%(V/V)。该液态发酵工艺为粗毛栓菌S13在工业上的应用奠定了理论基础和技术支持。