分离自陕西泾阳番茄的番茄黄化曲叶病毒(TYLCD)的分子特征

从陕西泾阳地区的番茄(Lycopersicon esculentum)上采集到73份表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄黄化曲叶病(Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)样品,利用双生病毒简并引物PA和PB及番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的通用引物TYT-F和TYT-R进行PCR扩增,共有70个样品检测呈阳性;利用双生病毒DNA-B及卫星DNA的通用引物,未扩增到相应目标条带;随机选取样品SX8,利用滚环扩增PCR(RCA-PCR)、克隆及测序等技术获得病毒DNA-A的全基因组序列,该DNA分子全长含2781bp(GenBank登录号:JN412854),与来自山东番茄的TYLCV分离物SD2(缩写为TYLCV-[SD2])(GenBank登录号:GU199587)的核苷酸序列相似性最高,为99.9%;系统进化分析发现,该病毒分离物与我国已报道的TYLCV各分离物亲缘关系较近。这些结果表明,陕西番茄黄化曲叶病是由TYLCV引起,该病毒可能来源于我国山东番茄上的TYLCV。     

番茄黄化曲叶病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立

以纯化的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)外壳蛋白为抗原,免疫家兔制备并纯化出TYLCV的多克隆抗体IgG,以此抗体做包被抗体,并用碱性磷酸酶(AP)对其进行标记作为酶标抗体,从而建立了番茄黄化曲叶病毒的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法。通过ELISA方阵试验确定该法的最佳工作浓度为酶标抗体(IgG-AP)作1∶400倍稀释,包被抗体浓度为6.25μg.mL-1;并且确定了抗原最低检出浓度为9.75ng.mL-1。采用该法对山东寿光的田间病样进行了定性和定量检测,结果表明建立的DAS-ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于番茄黄化曲叶病毒的常规检测。     

番茄双链RNA绑定蛋白(SlDRB)基因家族鉴定及抗TYLCV防御反应分析

番茄生产是现代蔬菜生产的主导产业,因经济价值高,成为乡村振兴的优势产业.然而番茄生产大多面临番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)和其他病毒的严重威胁.最新研究发现双链RNA结合蛋白(DRB)在植物RNA干扰(RNAi)抗病毒通路中发挥重要作用.为探究番茄DRB(SlDRB)基因抗TYLCV防御反应,本研究通过生物信息学方法鉴...     

RNA干扰V1和C1提高番茄植株对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性

为了获得高抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)番茄材料,本研究通过人工设计以TYLCV病毒基因V1、C1为靶标的双链RNA(dsRNA),通过农杆菌介导法转化番茄,探索RNAi技术在番茄抗TYLCV中的防御效果。结果表明,通过RNAi技术干扰TYLCVV1和C1基因可以延缓病毒症状的发生,提高番茄植株对TYLCV的抗性。田间试验结果发现,以TYLCV V1和C1为靶标的RNAi株系RNAi-CP-2和RNAi-Rep-12,不仅可以干扰病毒V1、C1的表达,而且可以干扰TYLCV其他4个基因V2、C2、C3和C4,表明RNAi技术可以在靶标基因附近传递,影响相邻其他基因的表达。本研究结果为番茄抗病毒研究奠定了理论基础。     

番茄抗黄化曲叶病毒育种研究进展

本文分别对近年番茄抗黄化曲叶病毒的传统育种、分子辅助育种、基因工程育种进展进行了综述。栽培番茄均不抗番茄黄化曲叶病毒,所以传统育种采用从野生近缘种中筛选抗性材料,以其为亲本与栽培番茄进行杂交来获得抗性;野生近缘种中的抗性位点Ty-1、Ty-2和Ty-3及一些QTLs先后被定位,也筛选出了可鉴定巩一,基因的SSR-47标记及鉴定Ty-3的SCAR标记;通过转基因技术获得抗性是研究热点之一,目前转入番茄后表现出抗性的序列有TYLCV病毒的CP基因、REP基因的部分序列或反义序列、不编码的保守序列以及源于白粉虱的GroEL基因。同时讨论了今后的主要发展方向。     

VIGS沉默番茄SlDCL2和SlDCL4破坏Ty-1/Ty-3对TYLCV的抗性

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)严重威胁茄科蔬菜作物的生产。抗性标记Ty-1和Ty-3是一对等位基因,在番茄抗TYLCV育种中应用较为广泛。为了探究Ty-1/Ty-3抗病毒分子机制,本研究以携带Ty-1/Ty-3抗性标记的番茄Y19为材料,利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术,沉默RNA干扰(RNAi)机制关键基因,即番茄核糖核酸内切酶编码基因2a/b/c/d(SlDCL2)和番茄核糖核酸内切酶编码基因4(SlDCL4),初步分析其在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的功能。PCR与测序结果发现SlDCL2、SlDCL4的VIGS沉默载体pTRV2∶SlDCL2和pTRV2∶SlDCL4构建成功。以沉默番茄八氢番茄红素脱氢酶(SlPDS)基因为标记植株,定量PCR检测SlDCL2、SlDCL4沉默株系中SlDCL2、SlDCL4基因的沉默效率,结果显示SlDCL2、SlDCL4沉默株系中对应基因的表达均小于对照植株的50%,表明SlDCL2、SlDCL4沉默载体确实可以降低对应基因的表达,且不影响其他DCL基因的表达。VIGS沉默植株SlDCL2、SlDCL4基因后接种TYLCV,接种TYLCV 30dpi结果显示,Y9材料表现出明显的TYLCV病毒症状,通过比较植株发病严重度发现,SlDCL2、SlDCL4沉默株系发病严重度分别为1.97、2.35,显著高于空载体注射株系(0.14)和对照株系(0.07)。本研究结果表明RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中发挥着重要作用,这为利用Ty-1/3抗性标记基因育种奠定了基础。     

樱桃番茄嫁接种苗生长及养分吸收差异研究

以海茄砧1号为砧木,以红粉A4为接穗,研究不同苗龄砧木与接穗养分吸收差异及接穗叶片数量对樱桃番茄嫁接种苗生长发育的影响。结果表明:同苗龄期,种苗所需氮磷钾钙镁养分砧木皆大于接穗,随着苗龄的增加,砧木与接穗氮磷钾含量均显著下降,接穗钙、镁含量趋向于增加,与砧木表现不同;随着苗龄的增加,砧木与接穗氮磷钾钙镁积累量均显著增加,砧木对钾需求量高出氮需求量约1.8倍,接穗两养分需求量相差不大;嫁接成活后21 d,2叶1心接穗嫁接的樱桃番茄嫁接种苗根系更发达,4叶1心长势更健壮,两处理壮苗指数均较高,分别为0.178、0.180。     

侵染云南白肋烟的中国番茄黄化曲叶病毒及伴随卫星DNA分子的基因组特征*

从中国云南省大理地区表现曲叶症状的白肋烟(Nicotina tabacum White Burley)上分离到病毒分离物Y43,该病毒可经烟粉虱(Bemisia tabaci)及嫁接传播。用15种粉虱传双生病毒的单抗对病样进行TAS-ELISA检测,结果表明,该病毒属菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒。对DNA-A1.7kb基因组序列测定和分析表明,Y43与中国广西报道的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato ycllow lcafcurl China virus,TYLCCNV)同源性达89％,其中外壳蛋白(CP)氨基酸同源性达96％,因此Y43应为TYLCCNV的一个新分离物。进一步研究发现,Y43还伴随着一个长l349nt的卫星DNA分子(DNAβ)。Y43 DNAβ与AYVV DNAβ、BYVMV DNAβ和CLCuV DNAβ的同源性较低,而与中国分离的烟草曲叶病毒Y5 DNAβ和Y8 DNAβ的亲缘关系较近。DNAβ可能编码7个分子量超过3．5kD的ORF,其中Cl推测为有功能的ORF。     

沙糖橘抗黄龙病苗木繁育技术

在感染黄龙病的疫区内,选育健康、生长良好且经PCR检测未感染黄龙病的沙糖橘植株作为母株,采摘其枝条嫁接于未感染黄龙病的酸橘砧木上,培育抗黄龙病的沙糖橘苗木。从"接穗筛选,接穗采集,苗圃地准备,砧木种子处理及播种,幼苗管理,营养土配制,砧木苗移植,砧木苗出圃,嫁接,嫁接苗管护"等各方面简介苗木培育技术。     

根癌农杆菌介导的转录因子DREB1A基因在地被菊花中的遗传转化

以地被菊花（Dendranthema grandiflomm cv．White Snow）无菌苗叶片为外植体，在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养，通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明，2．0mg/L 6-BA和0．2mg/L NAA组合可获得93．8％的再生芽。将含拟南芥（Arabidopsis thaliana）逆境诱导转录因子DREB1A基因的植物表达载体pBI-DREB1A导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，农杆菌介导法遗传转化地被菊花White Snow叶盘，经PCR和PCR—Southem检测，DREB1A基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中，预培养2d后，将OD600=0．5～0．7的根癌农杆菌稀释30倍后侵染叶盘10min，再共培养2d，有利于获得最高遗传转化效率。     

BTH诱导番茄耐番茄斑萎病毒(TSWV)研究

番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Orthotospovirus,TSWV)是番茄生长过程中发生严重的病毒病之一,严重威胁世界各地番茄的安全生产。为了研究植物诱导抗性在番茄抗TSWV中的防御作用,本研究以矮番茄为研究对象,使用苯并噻二唑(BTH)前处理番茄植株,研究BTH诱导的TSWV抗性,并分析BTH处理番茄植株后的发病严重度、病毒含量、植株抗氧化能力、质膜稳定性、细胞的解离情况,以及SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表达量。结果表明,0.1 mmol·L^-1BTH前处理番茄植株能够诱导丝裂原活化蛋白激酶级联信号通路关键基因SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表达,提高细胞抗氧化酶活性及质膜稳定性,并减轻病毒对细胞的破坏,从而增强番茄植株对TSWV耐性,抑制TSWV在番茄植株中的复制,BTH前处理植株发病的严重度显著低于对照。本研究为诱导植物抗病毒研究奠定理论基础。     

BTH诱导番茄耐番茄斑萎病毒(TSWV)研究

番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Orthotospovirus,TSWV)是番茄生长过程中发生严重的病毒病之一,严重威胁世界各地番茄的安全生产。为了研究植物诱导抗性在番茄抗TSWV中的防御作用,本研究以矮番茄为研究对象,使用苯并噻二唑(BTH)前处理番茄植株,研究BTH诱导的TSWV抗性,并分析BTH处理番茄植株后的发病严重度、病毒含量、植株抗氧化能力、质膜稳定性、细胞的解离情况,以及SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表达量。结果表明,0.1 mmol·L^-1BTH前处理番茄植株能够诱导丝裂原活化蛋白激酶级联信号通路关键基因SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表达,提高细胞抗氧化酶活性及质膜稳定性,并减轻病毒对细胞的破坏,从而增强番茄植株对TSWV耐性,抑制TSWV在番茄植株中的复制,BTH前处理植株发病的严重度显著低于对照。本研究为诱导植物抗病毒研究奠定理论基础。     

热红外成像用于番茄花叶病早期检测的研究

由于蒸腾作用与植物叶片温度成负相关;利用热红外成像技术研究感染番茄花叶病的番茄叶片表面温度的变化与叶片病变程度的关系,可为实现番茄花叶病早期检测提供依据。以感染番茄花叶病的番茄叶片为材料,在温室条件下,利用热红外成像仪连续检测受病害侵染的番茄叶片表面的温度变化,发现在叶片的病变部位高于正常叶片0.5～1.2℃,且在肉眼无法观测到病变时,从热红外图像已经能发现感染叶片与正常叶片间明显的温度差异。因此,在温室条件下,感染番茄花叶病的叶片表面温差可以显著反应番茄叶片染病程度,叶面温差可以作为鉴别叶片是否感染番茄花叶病的一个指标,将热红外成像技术运用于番茄花叶病早期检测是可行的。     

拟南芥14-3-3蛋白GRF9调控番茄根系响应水分胁迫的生理机制

采用35S启动子控制Arabidopsis General Regulatory Factor 9 (AtGRF9)在两个转基因番茄株系(E2,E7)中高效表达,以野生型番茄WT、转基因番茄E2和E7三个株系为试验材料,在水培条件下用20%聚乙二醇(PEG6000)模拟干旱胁迫,探究了拟南芥14-3-3蛋白GRF9能否增强番茄根系响应水分胁迫的能力。结果表明:①在干旱胁迫下,野生型番茄和转基因番茄的根系形态指标均受到不同程度的抑制,WT、E2和E7三个番茄材料相对总根长的受抑制程度分别为43%、28%、30%,相对根表面积的受抑制程度分别为46%、33%、35%,相对根体积的受抑制程度分别为47%、32%、29%,相对根直径的受抑制程度分别为29%、21%、22%。②在响应干旱胁迫时,转基因番茄根系蔗糖含量比野生型番茄高20%,根系干物质量比野生型番茄高23%。③在干旱胁迫时,转基因番茄根系质膜H+-ATPase酶活性较高,具有较强的分泌质子的能力,其根系泌酸量比野生型番茄高35%。因此,GRF9能够促进番茄根系蔗糖含量的增加和干物质的累积、增强根系分泌质子的能力,这对于转基因番茄根系...     

番茄PLC基因家族鉴定及抗番茄褐色皱果病毒（ToBRFV）防御反应分析

番茄褐色皱果病毒（ToBRFV）被我国列为检疫性病毒,严重威胁番茄的安全生产。为了明确番茄磷脂酶C(PLC)的种类,探究番茄PCL在植株抗ToBRFV防御反应过程中的潜在作用。本研究首先基于生物信息学鉴定了10个番茄PLC家族成员,其中特异性磷脂酶C(PI-PLC)7个,非特异性磷脂酶C(NPC)3个,7个PI-PLC蛋白均具备3个核心结构域（PLC＿X c、PLC＿Y c、C2）和1个EF＿hand-like结构域,3个NPC蛋白均只具有Phosphoesterase结构域。10个番茄PLC蛋白按照结构相似度可以划分为7个分支,分别为NPC1、NPC2、NPC6、PI-PLC2、PI-PLC3、PI-PLC4、PI-PLC6。另外,10个番茄PLC蛋白的二级结构占比类似,但三级结构存在明显差异。共线性分析结果显示,番茄PLC基因与水稻、拟南芥、雷蒙德式棉PLC基因间分别存在3、12、16对共线性关系。最后,通过转录组测序方法,检测了PLC基因家族在接种ToBRFV后的相对表达水平,结果显示,SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4在ToBRFV接种的样本中表达水平较高,其他PLC基因...     

The HSP terminator of Arabidopsis thaliana induces a high level of miraculin accumulation in transgenic tomatoes

High-level accumulation of the target recombinant protein is a significant issue in heterologous protein expression using transgenic plants. Miraculin, a taste-modifying protein, was accumulated in transgenic tomatoes using an expression cassette in which the miraculin gene was expressed by the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the heat shock protein (HSP) terminator (MIR-HSP). The HSP terminator was derived from heat shock protein 18.2 in Arabidopsis thaliana . Using this HSP-containing cassette, the miraculin concentration in T0 transgenic tomato lines was 1.4-13.9% of the total soluble protein (TSP), and that in the T1 transgenic tomato line homozygous for the miraculin gene reached 17.1% of the TSP. The accumulation level of the target protein was comparable to levels observed with chloroplast transformation. The high-level accumulation of miraculin in T0 transgenic tomato lines achieved by the HSP terminator was maintained in the successive T1 generation, demonstrating the genetic stability of this accumulation system.