拟南芥Ca~(2+)泵基因ACA_2的RNAi载体的构建及转基因植株的筛选

构建了含拟南芥Ca2+泵基因ACA2特异片段反向重复结构的RNA i载体,通过根癌农杆菌介导转化拟南芥,用卡那霉素筛选和PCR检测,获得了12个T3代纯合体转基因株系;半定量RT-PCR方法检测ACA2在转基因株系中转录的结果表明,其转录产物比野生型(WT)明显降低,且转基因株系之间差异明显,表达水平有1个梯度关系,因此,我们初步确定沉默Ca2+泵基因ACA2的RNA i载体是起作用的。     

拟南芥抗灰霉病相关基因BRG2的RNAi载体构建及转基因植株的筛选

为研究BRG2基因在拟南芥抗灰霉病过程中的作用及其调控机理,试验构建了含拟南芥抗灰霉病相关基因BRG2特异片段反向重复结构的RNA干扰(RNAi)载体,通过根癌农杆菌介导转化拟南芥及潮霉素筛选和PCR检测,获得了3株阳性转基因植株;半定量RT-PCR检测转基因株系中BRG2的表达情况,结果发现,转基因株系中BRG2的表达产物比野生型(WT)明显降低,且转基因株系之间差异明显,表明该干扰载体转入拟南芥能特异引起植株中BRG2基因表达量下降。     

拟南芥AtSEC14基因反义RNA植株的获得及抗病性检测

为确定拟南芥抗灰霉病相关基因AtSEC14的功能,本试验构建了AtSEC14基因的反义RNA载体;通过农杆菌介导的遗传转化方法,将其转化拟南芥野生型Col-0中;利用潮霉素抗性筛选和PCR检测,获得了阳性转基因植株。利用半定量RT-PCR技术,在转基因株系中未检测到AtSEC14基因的表达,说明该基因反义RNA载体的转入能特异影响AtSEC14基因的表达,表明试验所获得的转基因植株是AtSEC14基因的反义RNA转基因植株。对所获得的反义RNA转基因植株进行抗病性鉴定,发现反义RNA转基因植株对灰葡萄孢的敏感性增强,表明AtSEC14基因在拟南芥抗灰葡萄孢过程中起正调控的作用。     

缺铁胁迫下转番茄铁载体蛋白基因八棱海棠对矿质元素吸收的影响

在不同浓度缺铁水培条件下,采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)测定转基因和非转基因植株叶片和根系Ca2+、Mg2+、Ni2+的含量。研究结果表明:在Fe2+浓度为1μmol.L-1时,转番茄铁载体蛋白基因(LeIRT2)八棱海棠株系叶片中Mg2+的含量显著低于非转基因株系,而根系Mg2+的含量显著高于非转基因株系;该浓度下转基因株系根部Ni2+含量显著高于非转基因株系,叶片中Ni2+含量与非转基因株系无显著差异。Fe2+浓度为10μmol.L-1时,转基因株系叶片和根系Mg2+、Ca2+的含量与非转基因株系无显著差异。Fe2+浓度为1μmol.L-1时,转基因株系叶片和根系Ca2+的含量与非转基因株系无显著差异。无铁条件下在叶片和根系中Ca2+、Mg2+含量无显著差异。     

拟南芥HsfA2基因转化地被菊的研究

利用农杆菌介导法将从哥伦比亚生态型拟南芥中克隆得到的热激转录因子A2基因导入地被菊‘北林黄’中,经抗生素筛选和分子检测,获得了8株阳性转化株系。利用RT-PCR方法对阳性转化株检测表明,其中7个株系中外源基因得到表达;高温胁迫处理结果也显示,转基因植株耐热胁迫能力显著高于非转基因植株。本文通过将外源AtHsfA2基因导...     

拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化

采用PCR技术扩增拟南芥PHOT2基因编码序列,并将其转入pSUPER1300超表达载体中,构建了pSUPER1300-PHOT2超表达载体,利用农杆菌介导花序转化法,转入拟南芥野生型gl1、phot1突变体中。PCR扩增及RT-PCR分析表明,该基因超表达,筛选到了潜在的转基因株系。     

过表达胡杨PeRIN4基因拟南芥提高质膜H+-ATPase活性和耐盐性

本文克隆了RIN4(RPM1-interacting protein 4)在胡杨中的同源基因PeRIN4,并在拟南芥中进行过表达,通过研究转基因株系的耐盐表型、质膜H+-ATPsae活性及H+ 、Na+、K+等的动态离子流,揭示了PeRIN4基因在植物响应和适应盐胁迫环境中的作用。利用定位载体pGreen0029-PeRIN4-GFP瞬时转化拟南芥叶肉细胞原生质体的方法,对胡杨PeRIN4蛋白进行亚细胞定位,发现该蛋白定位在细胞的胞质中。耐盐表型实验结果显示,在100 mmol/L NaCl处理下,拟南芥PeRIN4过表达株系(OE1和OE8)的生存率和根长均明显高于野生型(WT)和转空载体拟南芥(VC),说明PeRIN4基因能够提高拟南芥的耐盐性。与WT和VC相比,拟南芥PeRIN4过表达株系质膜H+-ATPsae的活性较高。动态离子流数据显示,在盐胁迫下,PeRIN4过表达株系外排H+和Na+ 离子的能力强于野生型和转空载体拟南芥,然而K+的外流却弱于WT和VC。因此,PeRIN4蛋白具有调节质膜H+-ATPsae活性的功能。拟南芥质膜H+-ATPsae活性的提高主要有两方面的作用:一是可以增强H+泵的质子动力势,驱动Na+/H+逆向转运蛋白,提高Na+外排的能力;二是抑制质膜的去极化,减少K+离子通过去极化激活的外向型K+通道(DA-KORCs)和非选择性阳离子通道(DA-NSCCs)外流,维持了K+/Na+平衡,从而提高PeRIN4转基因拟南芥的耐盐性。      

拟南芥血红蛋白1（AtGLB1）超量表达载体和RNAi表达载体的构建及转化

为研究拟南芥血红蛋白1基因(AtGLB1)的功能,将AtGLB1基因构建入超表达载体pMD和RNAi载体pZYI中,并采用花序浸染法将重组质粒转化拟南芥Columbia得到了转基因植株。对超表达株系和RNAi株系的纯合体进行Northern分析,结果表明:超量表达的拟南芥株系中AtGLB1的表达水平比野生型高很多,而表达被抑制的RNAi株系中几乎检测不到AtGLB1基因的表达。这些AtGLB1表达水平不同的拟南芥株系的获得可为该基因功能的后续研究以及在农业生产中的应用奠定一定基础。     

过表达胡杨PePKS5提高拟南芥耐盐性

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分,在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上,探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因,并在拟南芥中过表达,获得T₃代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型,测定其过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na⁺、K⁺动态离子流,利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na⁺和H₂O₂含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标,揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体,通过瞬时转化烟草,对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】(1)PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸,PePKS5氨基酸序列与...     

过表达截形苜蓿液泡膜H~+-PPase基因促进拟南芥的生长和根围酸化

在前期研究工作中,中国科学研究院西北高原生物研究所分子实验室已从豆科模式植物截形苜蓿(Medicago truncatula)中克隆到一种液泡膜焦磷酸酶(V-H~+-PPase)基因Mt VP1,并进行了序列分析。在前期工作的基础上,构建植物表达载体pBI121-Mt VP1,把Mt VP1基因转入到拟南芥中,观察转基因拟南芥的表型变化。结果表明,过表达Mt VP1能使转基因株系的根系更发达,主根数增多1~2条,地上部生物量增大,并且促进了转基因株系的根围酸化能力;但幼苗耐盐性试验表明,转基因株系与对照没有明显差异。     

转基因水稻抗纹枯病性的杂种优势与配合力

用2个雄性不育系和5个转几丁质酶基因抗病品系按NCTI设计配制10个杂交组合,研究了转基因杂交水稻的杂种优势和配合力效应。结果表明,转基因水稻各抗性指标的一般配合力达极显著水平,但一般配合力的高低与其抗病性的强弱并不完全相关,而与其组合抗性呈极显著正相关;转基因杂交稻抗纹枯病性的超亲优势强度小,但组合间抗性差异极显著,病级和病情指数的特殊配合力也达极显著水平;转基因杂交稻抗纹枯病性遗传力高,受加性和非加性遗传共同控制,以加性遗传较为重要,源于转基因父本的加性效应明显高于不育系母本的加性效应。转基因水稻E14-1和Pin4具有较好的一般配合力效应,在抗病育种中有较大的利用价值;杂交组合Hai 3S／Pin 4和GD1／E14-1特殊配合力效应突出,是初步筛选出的优良抗性组合。     

NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响

为了筛选耐苏打盐渍土的转基因杨树优良株系, 以苏打盐渍土的主要成分NaHCO₃胁迫处理转TaLEA基因的山新杨各株系与对照(NT),测定不同株系的苗高和地径等生长性状,测定净光合速率(P_n)、胞间CO₂浓度(C_i)、气孔导度(G_s)、蒸腾速率(T_r)等光合参数以及最大光化学效率(F_v/F_m)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(NPQ)、实际光化学电子产量(Φ_PSII)等叶绿素荧光动力学参数,利用染色法分别比较各株系的超氧离子和过氧化氢的累积情况,进而综合评价不同株系对NaHCO₃胁迫的响应。结果表明,NaHCO₃胁迫处理前、后各株系的苗高和地径生长量发生明显分化,由处理前的差异不显著,到处理20 d后的显著,转基因株系的苗高、地径普遍较对照高,表现突出的是转基因株系SL2号,其平均苗高和地径分别较对照提高了17.4%、15.7%;对照的盐害指数是转基因株系的3.3倍,并且转基因株系的平均存活率是对照的2.8倍。各转基因株系的光合参数和荧光参数也较对照增强,P_n、T_r在胁迫20 d后转基因株系较对照分别高了237.38%、649.02%,G_s、C_i在胁迫15 d时转基因株系较对照分别高了119.05%、24.56%,其中SL2号转基因株系较对照分别提高150%、25.81%。各转基因株系的F_v/F_m平均为0.68,对照只有0.45,前者的qP和Φ_PSII只略高于后者,后者的NPQ却是前者的6倍。转基因株系的超氧离子和过氧化氢累积量均少于对照。在相同的碱胁迫环境下,转基因山新杨,尤其是SL2,能保持较快的生长量、较强的光合能力和较低的ROS水平,初步选择其为耐苏打盐渍土的杨树转基因优良株系。      

反义Wx基因导入我国常规籼稻品种的研究

经农杆菌介导，将自行克隆并构建的反义Wx基因导入4个高直链淀粉含量的常规籼稻品种绿黄占、清芦占11号、三芦占7号和特青中，经潮霉素抗性筛选获得抗性植株。聚合酶链反应(PCR)和Southern杂交检测证明反义Wx基因已整合进转基因水稻植株的基因组中。对成熟种子直链淀粉含量的分析表明，部分转基因水稻植株T1或T2代种子中的直链淀粉含量有不同程度的下降，最低的已降至16．52％，较对照下降了40．5％；在此基础上筛选获得了部分转基因纯合株系。研究结果还表明，盲链淀粉含量的改变会导致相应稻米的胶稠度和糊化温度的变化。     

转BpCCR1正义链及反义链对7年生盆栽白桦木质素的影响及优良株系选择

目的肉桂酰辅酶还原酶（Cinnamoyl-CoA Reductase，CCR）是催化木质素合成特异途径中的第一个限速酶。通过测定转基因株系和野生型株系（WT）的木质素和单体含量，探究转BpCCR1基因正义链和反义链对白桦木质素含量的影响，进而筛选出转基因优良株系。方法以获得的7年生白桦转BpCCR1正、反义链株系为试验材料，采用PCR及qRT-PCR技术分别对目标基因的稳定性及表达量进行检测，采用改进的Klason法及液相色谱法分别对木质素含量及单体含量进行测定，采用硝酸－氯酸钾法和排水法分别对木纤维长和宽及基本密度进行测定，并调查树高及胸径，以此来分析转BpCCR1正、反义链对白桦上述性状的影响。结果PCR检测表明，5个转正义链株系及14个转反义链株系的目标基因均为阳性；qRT-PCR分析显示，BpCCR1基因不但在转正义链株系中上调表达，而且在转反义链株系中也呈上调表达。转正、反义链白桦株系木质素含量均增加，其中10个转反义链株系的Klason木质素和总木质素含量均值较野生型株系（WT）分别提高了7.46%和7.05%，木质素含量最高的FCR11株系较WT株系分别提高了12.26%和11.81%；转基因株系基本密度虽然有一定的变化，但无明显规律。转正义链株系的木纤维宽明显变小，5个株系均值较WT减少8.82%；而转反义链株系的木纤维长受到明显抑制，有11个株系与WT的差异达到了显著性水平（P < 0.05），其均值较WT减少12.12%。转基因株系与WT的材积差异也达到显著性水平，有11个转反义链株系的材积大于WT，7个株系达到显著性水平（P < 0.05），其平均材积生长量较WT提高77.1%。采用主成分分析法选择FCR2、FCR27和FCR33株系为优良株系。结论转BpCCR1正义链及反义链均提高白桦木质素含量，综合树高、胸径等6个性状筛选出3个优良转基因株系。      

水通道蛋白基因OsPIP2;6的功能分析

【目的】分析水稻过表达OsPIP2;6在逆境胁迫条件下的表型差异,探讨水通道蛋白基因在水稻逆境应答中的作用。【方法】构建水稻水通道蛋白OsPIP2;6的过表达载体,通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,得到转基因植株。通过逆境胁迫下转基因植株的表型分析来探讨OsPIP2;6的功能。【结果】Real-time PCR结果显示,OsPIP2;6受GA、ABA调控。转基因植株的OsPIP2;6表达量显著提高。正常条件下,转基因植株与野生型植株生长发育情况并无显著差异。在逆境胁迫条件下,转基因植株的耐受能力均显著强于野生型植株。【结论】过表达水稻水通道蛋白基因OsPIP2;6的转基因植株表型显示,OsPIP2;6在水稻的抗旱、抗水淹和抗盐中发挥作用。     

抗真菌转基因大豆对大豆疫霉根腐病抗病性鉴定

采用下胚轴伤口接种法,对Southern杂交阳性的转菜豆几丁质酶基因和大麦核糖体失活蛋白基因的双价转基因大豆T2代的5个株系,进行了大豆疫霉根腐病抗病性检测,并通过比较接种后转基因大豆与对照组的死亡率来探讨两者的抗病性差异。结果表明,有4个转基因株系对大豆疫霉根腐病的抗性与非转基因对照组相比有明显提高,另外1个株系与对照组相比没有明显差异。     

转Hpa110-42小麦分子鉴定及赤霉病抗性功能评价

【目的】筛选出抗赤霉病转Hpa110-42小麦植株,为抗赤霉病小麦新品种的选育提供材料。【方法】以转Hpa110-42小麦T2植株和受体扬麦158为供试材料,通过PCR、Southern blotting、RT-PCR等分子技术进行外源基因的整合与表达检测,并采用单花滴注法鉴定转基因小麦的赤霉病抗性,同时探讨其抗性生理。【结果】经分子检测证明,外源Hpa110-42以1—3个拷贝整合到小麦基因组中并能够稳定遗传,在转录水平上也能正常表达。赤霉病抗性鉴定表明,株系T2-17、T2-15、T2-68、T2-44和T2-36的平均病小穗率极显著低于扬麦158。除T2-17外,其余株系的平均病小穗率极显著高于苏麦3号,均未达到苏麦3号的抗性水平。T2-17株系平均病小穗率显著低于T2-15、T2-68和T2-44,极显著低于T2-36、T2-11和T2-20株系。抗性生理分析显示,接种赤霉菌孢子后,所有植株的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性均上升,但转基因高抗植株比扬麦158上升更快,而感病株上升相对缓慢;尽管可溶性蛋白含量呈下降趋势,但转基因植株的高抗植株始终高于其它株。β-1,3-葡聚糖酶活性和可溶性蛋白含量与赤霉病抗性等级值呈极显著负相关。【结论】外源Hpa110-42整合到小麦基因组中,能稳定遗传并正常表达,正向参与了小麦赤霉病抗性调控,获得了抗赤霉病转Hpa110-42小麦植株。     

转雪花莲凝集素(GNA)基因抗蚜大豆后代材料的田间试验

本试验对稳定的转基因大豆品系在控制条件下进行了2年的大田试验。试验结果表明,转基因品系的农艺性状与受体对照无明显差异,抗蚜性明显优于受体对照。     

兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定

【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319）,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中,对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值;采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中,对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系,其中株系L1-L3来自自交系9801,Q1-Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度,证明它们在转基因植株中有效表达;利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平,确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中,转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间,转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性,对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS一同转入玉米,赋予了植株抗玉米螟、抗除草剂草甘膦特性,提高了植株的抗旱性,达到生产中应用标准。培育出具有优良复合性状的转基因玉米新材料。