壳寡糖对黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝细胞毒性损伤的干预作用

为了研究壳寡糖（COS）对黄曲霉毒素B1（AFB₁）诱导大鼠肝细胞（BRL 3A细胞）毒性损伤的干预作用。采用CCK-8法分别测定AFB₁对细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）和COS对细胞的无损害作用浓度;用试剂盒检测COS预处理细胞6 h后再加入AFB₁继续培养24 h的细胞存活率、活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性和细胞凋亡率;通过Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）测定Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1、Bax和Bcl-2基因的mRNA相对表达量;最后通过RNA-seq研究分析差异表达基因的层次聚类和富集途径。结果：AFB₁对BRL 3A细胞的IC₅₀为15.86 μmol/L,COS浓度小于125 μmol/L时不会对细胞造成毒性损伤;COS可以缓解AFB₁引起的细胞内ROS水平和MDA含量升高,增强SOD和GST酶活性,进而提高细胞自身的抗氧化能力,降低细胞凋亡率;AFB₁可引起促凋亡基因Bax的显著表达（P<0.05）,并显著降低Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1的转录水平（P<0.05）,而COS预处理则能显著提高Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1基因的表达（P<0.05）,显著降低Bax的表达水平（P<0.05）;在RNA-seq的富集途径结果中,COS还可能通过细胞色素P450对外源物质的代谢作用、药物代谢-细胞色素P450和p53信号通路途径来缓解AFB₁诱导的细胞毒性损伤（P<0.05）。结果表明：COS预处理对AFB₁诱导大鼠肝细胞的毒性损伤具有干预作用,其机制可能与Nrf2信号通路、细胞色素P450对外源物质的代谢作用、药物代谢-细胞色素P450和p53信号通路有关。     

黄体期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1与RFRP-3组织表达研究

为分析KiSS-1和RFRP-3基因在小尾寒羊不同繁殖时期(黄体期和卵泡期)下丘脑、垂体、性腺轴各组织中的表达差异,阐明这2个基因在绵羊发情转换中的表达模式,以常年发情的小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对比分析了KiSS-1和RFRP-3基因在黄体期和卵泡期的小尾寒羊下丘脑—垂体—性腺轴各组织中的表达差异。结果表明:1)KiSS-1和RFRP-3基因在下丘脑、垂体、卵巢等10种组织中均有表达;2)黄体期和卵泡期下丘脑中KiSS-1基因表达量均显著高于其他组织(P0.05),卵泡期下丘脑和松果体中KiSS-1基因表达量均显著高于黄体期(P0.05);3)黄体期和卵泡期下丘脑和卵巢中RFRP-3基因的表达量均显著高于其他组织(P0.05),且卵巢中RFRP-3基因在黄体期的表达量显著高于卵泡期(P0.05)。综上,研究发现KiSS-1和RFRP-3基因在绵羊发情调控中均发挥重要作用,KiSS-1促进发情而RFRP-3抑制发情。     

东湖F1代BMPR-1B和BMP15基因多态性 与产羔性能关联性分析

为探究候选基因BMPR-1B、BMP15与东弗里生羊♂和湖羊♀的杂交F₁代（东湖F₁羊）产羔数间的关联性,评估东弗里生羊作为引入品种的经济利用价值,使用PCR-RFLP技术对东湖F₁羊和湖羊的BMPR-1B、BMP15基因多态性与产羔数进行关联分析。结果显示,东湖F₁羊与湖羊群体内均未检测出BMP15基因的FecX^I突变。BMPR-1B基因FecB突变位点在湖羊群体中检测出AG、GG两种基因型,基因频率分别为0.064和0.936,优势基因型为GG型,等位基因A、G的基因频率分别为0.032和0.968,优势基因为等位基因G;在东湖F₁羊群体中检测出AA、AG和GG 3种基因型,基因频率分别为0.146、0.683和0.171,优势基因型为AG型,等位基因A、G的基因频率分别为0.488和0.512。表明对产羔有利的G等位基因可以通过东弗里生和湖羊杂交遗传给后代,可作为其分子育种的辅助选择标记。湖羊AG型与GG型个体产羔数差异不显著（P＞0.05）,东湖F₁羊 GG型、AG型个体产羔数极显著高于AA型个体（0.01＜P＜0.05）,GG型与AG型个体产羔数差异不显著（P＞0.05）。结果表明东湖F₁羊产羔数与BMPR-1B基因显著相关。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

陕西市售液态牛奶中黄曲霉毒素M1污染水平分析及风险评估

【目的】全面评价陕西液态牛奶中黄曲霉毒素M_1(aflatoxin M_1,AFM_1)污染状况及其产生的健康风险。【方法】于2018年上半年在陕西全省范围内城市、县城及乡镇采集液态奶样本111份进行检测,结合中国居民营养与健康状况监测数据库中液态奶消费数据,对不同人群通过液态奶对AFM_1的摄入水平进行分析。采用联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JECFA)确立的AFM_1暴露引发肝癌风险公式和安全限值两种方法,分析描述相关健康风险。【结果】111份液态奶样本中95份检出AFM_1,但均未超过国家限量标准,平均含量为23.95 ng/kg。不同性别年龄组中,一般人群对AFM_1的平均摄入量为0.004～0.082 ng/(kg·d),肝癌风险为0.010～0.225例/(亿人·年),消费人群对AFM_1平均摄入量为0.041～0.272 ng/(kg·d),肝癌风险为0.113～0.745例/(亿人·年)。【结论】陕西液态牛奶中AFM_1污染引发的健康风险总体较低,但需对部分低年龄段(2～11岁)液态奶消费人群AFM_1膳食暴露引发的健康风险予以关注。     

AFB1对犬肝细胞的毒性作用及NAC的保护效应

【目的】以犬原代肝细胞为模型,研究黄曲霉毒素B_1(AFB_1)对肝细胞的毒性作用以及N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对细胞损伤的保护效应。【方法】选取1～2月龄幼犬,取肝细胞培养至对数生长期,分别用0(对照),0.05,0.25,1.25,6.25,31.25μg/mL AFB_1和6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理36 h后,观察细胞形态结构,检测肝功能相关指标、氧化与抗氧化功能指标及细胞凋亡相关基因cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA表达量。【结果】显微观察发现,与对照组相比,0.05～6.25μg/mL AFB_1处理组的细胞数量减少,细胞失去饱满性,细胞凋亡、坏死情况明显;6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理组的细胞饱满且活性良好,细胞数目增加,结构完整。与对照组相比,1.25～31.25μg/mL AFB_1处理组的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性均显著上升(P0.05);0.05～31.25μg/mL AFB_1处理组的碱性磷酸酶(ALP)活性显著升高(P0.05);1.25～31.25μg/mL AFB_1处理组的γ-谷氨酰转移酶(γ-GGT)活性显著降低(P0.05),0.05～0.25μg/mL AFB_1处理组的γ-GGT活性显著增加(P0.05); 31.25μg/mL AFB_1处理组的白蛋白(ALB)质量浓度显著降低(P0.05)。与对照组相比,0.05～0.25μg/mL AFB_1处理组的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和丙二醇(MDA)含量显著增加(P0.05);1.25～31.25μg/mL AFB_1处理组的H_2O_2质量浓度显著增加(P0.05)。与对照组相比,0.05～31.25μg/mL AFB_1处理组的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性无显著变化;0.25～31.25μg/mL AFB_1处理组的过氧化氢酶(CAT)活性显著降低(P0.05)。与6.25μg/mL AFB_1处理组相比,6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理组的AST、ALP、r-GGT活性以及ALB、8-OHdG、MDA、H_2O_2水平显著降低(P0.05),CAT和GSH-Px活性显著升高(P0.05)。6.25μg/mL AFB_1处理细胞的凋亡率为12%,极显著高于对照组和6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理组。与对照组相比,0.05～6.25μg/mL AFB_1处理组的cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA的表达量极显著增加(P0.01);与6.25μg/mL AFB_1组相比,6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理组的cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA表达量均极显著降低(P0.01)。【结论】AFB_1能够抑制犬原代肝细胞活性,引起细胞形态、肝功能指标及细胞氧化与抗氧化功能异常,加快细胞凋亡;NAC能够显著提高抗氧化酶活性,降低AFB_1所致肝细胞的损伤和凋亡水平,对肝细胞具有一定的保护性。     

梭梭 HaNAC20基因克隆及特性分析

为深入分析 HaNAC20转录因子在梭梭抗逆机制中的作用,以梭梭［Haloxylon ammodendron(C.A.Mey.) Bunge］ HaNAC20转录因子为对象,克隆其编码基因,对其基本理化性质、所属亚族及同源基因进行生物信息学分析,使用qRT-PCR方法对 HaNAC20在模拟干旱、高盐、模拟地表高温、IAA、ABA处理下的表达量进行分析,构建表达载体,进行亚细胞定位及转录激活活性分析。结果表明：克隆得到1个编码区全长为822 bp的梭梭NAC转录因子家族基因,命名为 HaNAC20(登录号：KU845314),编码273个氨基酸。系统发育树显示 HaNAC20属于NAC家族中与非生物胁迫相关的SNAC亚族。核定位信号预测及亚细胞定位结果表明 HaNAC20定位于细胞核内。表达量分析结果显示：在模拟干旱、高盐、模拟地表高温、IAA、ABA处理下, HaNAC20表达量均显著上调。转录激活分析结果显示该转录因子C端具有转录激活活性。表明 HaNAC20基因在梭梭响应非生物逆境胁迫、提高梭梭抗逆性中发挥重要作用。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

唐菖蒲蛋白磷酸酶GhPP2C1基因功能及其对ABA的响应

为探究唐菖蒲GhPP2C1（Protein phosphatase 2C1）的功能及对脱落酸（Abscisic acid,ABA）的响应,以唐菖蒲‘Rose Supreme’为试材,利用同源克隆的方法获得ABA信号转导过程中的关键蛋白磷酸酶基因GhPP2C1,利用实时荧光定量分析、亚细胞定位和启动子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色等方法检测其对ABA的响应情况;对其启动子序列进行响应元件分析;在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因,对转基因株系进行ABA敏感性测定、株型分析及下游基因表达情况分析。结果表明：1）GhPP2C1的表达在ABA处理的诱导下显著上调。2）GhPP2C1定位于细胞质中,可被ABA处理诱导入核。3）GhPP2C1基因启动子包含ABA、赤霉素（Gibberellins,GAs）、干旱和低温相关响应元件。在烟草叶片和拟南芥根尖中,GhPP2C1启动子活性可被ABA激活。4）在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因导致ABA信号通路中下游基因的表达量显著下降并出现分枝数、株高和种荚数量明显增加的表型。综上,推测唐菖蒲GhPP2C1可能通过减弱ABA信号传导,促进种子休眠解除,且在植株营养生长过程中也发挥作用。     

梭梭VHA B基因克隆及序列分析

采用RT PCR和RACE法从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中扩增出VHA B基因cDNA序列，其开放阅读框为1 413 bp，推测编码全长为471个氨基酸残基的氨基酸序列，该蛋白分子量约为52.304 ku，等电点为5.08。运用SMART、DNAMAN、GOR4、TMPred等生物信息学软件对梭梭VHA B功能域、跨膜结构进行分析显示，梭梭VHA B含有3个ATP synt_ab_N 、ATP synt_ab、ATP synt_ab_C结构域，但是不含跨膜结构域和信号肽。氨基酸序列同源性结果显示，HaVHA B与盐爪爪、盐穗木、碱蓬等同源性高达89.68%。说明VHA B基因是一个高度保守基因。     

Classification of toxigenic and atoxigenic strains of Aspergillus flavus with hyperspectral imaging

Aspergillus flavus (A. flavus) produces secondary metabolites, aflatoxins, that are harmful to both humans and animals. Because of stringent federal regulation requirements as well as the limitations of available detection methods, there is an urgent need for rapid, non-invasive and effective techniques such as hyperspectral imaging, for the detection of the toxigenic strains of A. flavus. Hyperspectral images of toxigenic and atoxigenic strains of A. flavus were classified. Principal component analysis (PCA) was applied for data decorrelation and dimensionality reduction. A Genetic Algorithm (GA) was implemented for the selection of principal components (PCs) based on Bhattacharya Distance (B-Distance). A Support Vector Machine (SVM) was successfully applied for the classification. Under halogen light sources, in average 83% of the toxigenic fungus pixels and 74% of the atoxigenic fungus pixels were correctly classified; while under UV light sources, 67% of the toxigenic fungus pixels and 85% of the atoxigenic fungus pixels were correctly classified. The pair-wise classification accuracies between toxigenic AF13 and each atoxigenic fungus species (AF38, AF283 and AF2038) were 80%, 91% and 95% under halogen light sources, and 75%, 97% and 99% under UV lights, respectively.     

微生物在防治黄曲霉菌及毒素中的应用

黄曲霉菌及其黄曲霉毒素对人类的严重危害是世界性难题,给粮食生产和人类健康带来了极大的损害。在对黄曲霉菌及毒素的防治研究中,微生物资源已被证明具有高效的抑菌作用。近年来,多种新颖的微生物资源被筛选和应用于防治田间或储藏期作物黄曲霉病害,取得了高效的应用价值。研究对近期报道的各类功能微生物在防治田间和储藏期黄曲霉菌及毒素的最新进展进行了综述,微生物通过竞争抑制、拮抗作用、毒素的吸附和降解、储藏期呼吸抑制、以及新发现的微生物挥发气体抑菌等方式发挥拮抗作用,为田间和储藏期作物的合理防控、食品安全和人类健康等提供重要的参考依据。     

抑制黄曲霉菌的乳酸菌的分离及鉴定

【目的】从新疆传统发面面肥中分离筛选出能够抑制黄曲霉菌生长的乳酸菌,为改善和提高青贮饲料品质提供优良菌种。【方法】采用实验室纯培养方法对新疆传统发面面肥样品进行乳酸菌的分离,采用双层平板法筛选对发霉花生、玉米和变质青贮饲料中黄曲霉菌具有抑制作用的乳酸菌,并对其进行生理生化鉴定及同源性分析,构建系统发育树,明确各菌株的分类地位。【结果】从新疆传统发面面肥中分离出12株乳酸菌,通过抑菌试验筛选出F3、F11和F12 3株对黄曲霉菌具有抑制作用的菌株。生理生化试验发现,3株菌株均能在5,10,40和45℃温度条件下生长,在NaCl为3%和6.5%,pH 4~7条件下能良好生长,并且这3株菌均能利用多种碳源。经16SrDNA序列同源性分析,菌株F3与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)MD9B2的同源性为100%,菌株F11与屎肠球菌(Enterococcus faecium)V9-156的同源性为100%,菌株F12与乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)25F1的同源性为100%。【结论】从新疆传统发面面肥中筛选出能够抑制黄曲霉菌的3株乳酸菌,经鉴定分别为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。     

The Metabolic Responses of Aspergillus flavus to N-Acetylcysteine, Ascorbate, and H2O2

Aflatoxin, the secondary metabolite of Aspergillus flavus and A. parasiticus, is the most toxic product in nature. In this study, N-acetylcysteine （NAC）, ascorbate, and H2O2 were used to ascertain their effects on fungal metabolic response of A. flavus. The results demonstrated that NAC did not affect fungal growth, but inhibited the aflatoxin Bt production, with the concomitant sporulation reduction. NAC increased the ratio of reduced glutathione （GSH） and oxidized glutathione （GSSG）, but decreased the activity of glutathione reductase （GR）. Ascorbate had similar effect on fungal growth, sporulation, and GR activity, but GSH/GSSG and total glutathione （tGSH, including GSH and GSSG） were significantly increased. H2O2 at high concentration （5 mM） inhibited fungal growth, but the aflatoxin production was increased. At the same time, it reduced GR activity and enhanced tGSH. Though reductive agents had different effects on GSH metabolism, reductive conditions inhibited aflatoxin production and sporulation without any effect on fungal growth. The results in this report confirmed that the relationship between oxidative stress and aflatoxin production is theoretically important in controlling aflatoxin contamination.     

影响黄曲霉孢子萌发的生化因子

研究了氨基酸、脂类、糖类、矿物质及维生素等生化因子对黄曲霉孢子萌发的影响,发现以上生化因子均在不同程度上对芽管形成有刺激作用.其中,维生素B1和B6、叶酸、十六酸、十二酸、果糖、菊糖、肌醇、半乳糖、KH2PO4、FeSO4、亮氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸对芽管形成有明显的刺激作用;而蔗糖、山梨糖、NaCl和MgSO4对芽管形成有抑制作用;葡萄糖和麦芽糖对芽管形成作用不明显.     

小菜蛾 Hsp20家族基因鉴定及 PxHsp20-8在温和低温中的表达模式

旨在鉴定小菜蛾Plutella xylostella 的 Hsp20家族基因,明确其在8 ℃和4 ℃低温条件下的表达模式。通过生物信息学手段,从小菜蛾染色体级基因组中鉴定出17条 Hsp20家族基因,分布在5条染色体,其中11个 PxHsp20s位于27号染色体;开放阅读框（ORF）长度为501~1 002,理论等电点5.65~8.05,蛋白分子质量18.80~36.60 ku。将对照组（26 ℃恒温）、短期低温组（4龄幼虫8 ℃ 24 h,以CS表示）、适应后短期低温组（3龄幼虫15 ℃适应后4龄幼虫8 ℃ 24 h,以CA表示）的小菜蛾4龄幼虫转录组进行分析,仅 PxHsp20-8差异表达。利用RT-qPCR对温和低温（8 ℃、4 ℃）、低温暴露时间（24 h、48 h、96 h）、4龄幼虫前是否经历适应（CS和CA处理）不同组合条件下小菜蛾4龄幼虫的 PxHsp20-8基因表达量进行检测。结果表明,处理温度高低和处理时长对 PxHsp20-8表达量无显著影响,4龄前经历15 ℃适应对表达量有显著影响;4龄幼虫CS组8 ℃ 48 h、4 ℃ 48 h、4 ℃ 96 h处理后 PxHsp20-8表达量显著高于26 ℃对照,而CA组8 ℃ 24 h、8 ℃ 48 h、4 ℃ 96 h处理后显著低于对照。相同温度—时间组合下,CS组8 ℃ 24 h、8 ℃ 48 h、4 ℃ 48 h、4 ℃ 96 h PxHsp20-8相对表达量显著高于CA组相应低温处理。     

紫色番茄SlWD40-like基因克隆与表达分析

WD-重复蛋白(WD-repeat protein)是一类含有WD40基序的蛋白,在植物响应非生物逆境胁迫的过程中具有重要调控作用。为揭示紫色番茄中WD40重复蛋白的功能,从富含花青素紫色番茄品种‘砚紫1号’中克隆 SlWD40-like基因,并对该基因在不同组织部位和不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明, SlWD40-like基因编码1个含有460个氨基酸的蛋白质。蛋白序列分析显示,SlWD40-like蛋白含有6个WD40基序,是典型的WD40重复蛋白。预测分析发现,该蛋白为亲水性蛋白,其二级结构以无规则卷曲为主;该蛋白序列在物种间具有高度的保守性,系统发生进化树分析表明紫番茄SlWD40-like氨基酸序列与潘那利番茄蛋白亲缘关系最近,其次是胡萝卜。应用qRT-PCR分析 SlWD40-like基因组织特异表达发现,该基因在叶和紫色果实中表达量最高。qRT-PCR分析表明, SlWD40-like基因受到盐胁迫、干旱胁迫脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导表达,推测该基因可能参与紫色番茄逆境胁迫应答。该研究为后续进一步分析紫色番茄 SlWD40-like基因功能奠定了基础。     

斑节对虾PmML1和PmML2基因的鉴定及表达分析

为进一步了解ML家族基因在斑节对虾先天免疫中的作用,采用PCR和RACE方法克隆到斑节对虾(Penaeus monodon)2个ML家族基因PmML1和PmML2,并对其进行生物信息学分析,同时通过实时荧光定量PCR技术分析2个ML家族基因在斑节对虾各组织的表达分布。结果显示：PmML1的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为462 bp,编码153个氨基酸;PmML2的ORF为471 bp,编码156个氨基酸。2个基因都具有1个典型的ML家族蛋白结构域。多重比对结果显示,2个基因的ML结构域与组成3对二硫键的半胱氨酸残基位置都相对保守。氨基酸序列对比结果显示,PmML1和PmML2之间的相似性仅为42.37%。PmML1与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的ML蛋白MjML4的相似性最高,比例高达91.5%,PmML2与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的ML蛋白相似性最高,比例高达88.46%。系统进化分析结果显示,PmML1和PmML2存在于2个不同的分支,说明2个基因的进化相对独立,证明本研究中鉴定到的是2个不...     

甘蓝型油菜BnaWRKY30-like基因cDNA序列克隆 及生物信息学分析

WRKY 转录因子是植物所特有的一个超级基因家族,能调控植物生长发育过程及逆境反应。根据转录组测序获得的 EST 序列设计引物, 利用 RT-PCR 及 RACE 技术克隆了甘蓝型油菜WRKY30 基因 cDNA 全长序列, 并运用生物信息学手段对序列进行了分析及预测。结果表明：BnaWRKY30-like 基因全长cDNA序列中包含102 bp 的5′-UTR序列,188 bp 的3′-UTR序列以及942 bp的完整ORF,编码313个氨基酸。该转录因子蛋白相对分子量为35 319.85D,等电点为 6.22,基本氨基酸中含量最高的丝氨酸（Ser）,313个氨基酸中含有41个酸性氨基酸,34个碱性氨基酸,在121～182区域含有一个典型的WRKY结构域。亚细胞定位预测发现该转录因子定位于细胞核的可能性最高。蛋白质的二级结构预测表明共有α-螺旋占26.20%,延伸链占10.54%,β-转角占4.47%,无规则卷曲占58.79%。BnaWRKY30-like基因编码的蛋白具有典型的WRKY转录因子特征,与拟南芥WRKY30基因亲缘关系近,可能在油菜早期生长发育过程及盐胁迫中的发挥调控作用。     

GFP标记拟南芥突变体sad2微管及F_2代幼苗的检测与分析

为观察拟南芥突变体sad2(sensitive to ABA and drought)的微管列阵,以拟南芥突变体sad2-1和sad2-2为母本,转GFP(green fluorescence protein)-α-tubulin野生型拟南芥为父本杂交,并对F2代幼苗进行叶表型分析、卡那霉素抗性筛选和荧光镜检。表型分析显示,拟南芥sad2-2突变体与转GFP-α-tubulin的杂交F2代幼苗叶片出现有毛和无毛2种性状,二者分离比为2.81∶1。卡那霉素抗性筛选显示,部分F2代幼苗在卡那霉素培养基上出现白化死亡,大部分可正常生长。荧光镜检显示,卡那霉素阳性苗的子叶出现GFP绿色荧光。此外,共聚焦显微镜观察显示,拟南芥突变体子叶细胞微管列阵清晰可见,且sad2-1和sad2-2两种突变体的微管比野生型更加致密,但sad2-1和sad2-2两突变体间无明显差异。说明:采用杂交法将GFP-α-tubulin引入突变体来分析微管是一种简便可靠的方法,且sad2基因影响细胞微管列阵,可用于sad2基因与微管功能的进一步研究。