鸡IL-6、IL-17和IFN-γ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台.     

IFN-γ在不同生殖周期奶山羊卵巢中的表达

应用免疫组织化学SP法检测γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)在不同生殖周期奶山羊卵巢中的表达情况,探讨IFN-γ的变化规律及其与生殖的关系。结果显示,在间情期三级卵泡颗粒细胞胞膜、发情期三级卵泡和成熟卵泡颗粒细胞、妊娠期卵泡颗粒细胞、妊娠7周粒黄体细胞、妊娠12,16和20周膜黄体细胞胞核中均有IFN-γ的表达;在三级卵泡和成熟卵泡的卵泡液中也有IFN-γ的表达;妊娠12,16和20周粒黄体细胞上IFN-γ表达量很低。IFN-γ可能在不同类型的细胞上发挥着不同的作用。     

怀孕期山羊腺垂体中IFN-α和IFN-γ的表达研究

【目的】研究α-干扰素(IFN-α)和γ-干扰素(IFN-γ)在怀孕前期(怀孕1～30d)、中期(怀孕31～120d)、后期(怀孕121～150d)山羊腺垂体中的分布及表达量的变化特点。【方法】以怀孕前、中、后期的山羊为试验动物,放血致死后采取其腺垂体制备切片,采用免疫组织化学SP法分别对怀孕前、中、后期山羊腺垂体内IFN-α、IFN-γ阳性细胞的分布及表达变化进行研究。【结果】2种干扰素阳性物质主要分布于腺垂体嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嫌色细胞中。不同怀孕期,IFN-α和IFN-γ的分布存在明显差异,前期和后期表达量较高,中期明显降低;在前、中、后各个怀孕时期,IFN-α的相对表达量均比IFN-γ多,在后期更为明显。【结论】IFN-α和IFN-γ在山羊腺垂体中的表达量因怀孕时期的不同而存在明显差异,其可能在不同怀孕时期发挥作用或相互协同调节垂体激素的合成与分泌,参与动物生殖的调节。     

IFN-γ在流产大鼠下丘脑的表达

为了探讨下丘脑对妊娠的调节作用,采用免疫组织化学SP法研究了妊娠中期,正常妊娠大鼠及流产大鼠下丘脑内IFN-γ阳性神经元的形态与分布,同时利用图像分析软件测定了其灰度值。结果显示,正常妊娠大鼠和流产大鼠IFN-γ主要在下丘脑的视前大细胞核、室旁核、视上核、下丘脑前核等部位分布,而流产大鼠的IFN-γ阳性细胞数多于正常妊娠组且表达强于正常妊娠组。表明IFN-γ在下丘脑的表达对妊娠大鼠的神经内分泌调节有重要影响。     

兔IFN-γ基因的克隆、遗传进化分析及其表达

运用RT-PCR技术对用ConA刺激后的中国白兔外周血淋巴细胞(PBMCr)进行扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行序列测定,并进行遗传进化分析.结果发现:该基因全长501 bp,编码167个氨基酸,其中前20个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IFN-γ基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IFN-γ氨基酸序列中,在41~43、108~110和117~119位存在3个潜在的N-联糖基化位点,同时存在3个Cys残基.转化重组质粒pETIFN-γ的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后,重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为22.6 kDa的重组蛋白.经凝胶薄层扫描,重组蛋白表达量可占菌体蛋白的19.2%.     

瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】构建瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ基因原核表达载体,并制备IFN-β和IFN-γ多克隆抗体,为进一步研究树鼩病毒感染动物模型打下基础。【方法】以瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞为原材料,提取总RNA后经RT-PCR扩增瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ基因,亚克隆至质粒pcDNA3.1（+）上构建真核表达载体,并瞬...     

鸡IFN-γ表达载体的构建

[目的]构建鸡IFN-γ的表达载体。[方法]采用PCR方法从pcDNA-ChIFN-γ重组质粒中扩增得到鸡IFN-γ基因,将目的基因定向克隆至能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE trisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达8×H is-tag标签蛋白并对其进行纯化。[结果]通过SDS-PAGE检测方法表明,ChIFN-γ基因片段成功表达。[结论]鸡IFN-γ的表达载体成功构建。     

鸵鸟小肠中IFN-γ的随龄性表达

为探讨γ-干扰素(IFN-γ)与鸵鸟小肠发育及小肠黏膜免疫的关系,运用免疫组织化学SP法分别对3日龄、3周龄和11月龄鸵鸟小肠中IFN-γ的表达进行研究。结果表明,IFN-γ免疫阳性细胞主要分布于肠上皮间淋巴细胞,在绒毛和肠腺的上皮细胞及杯状细胞内也有阳性产物表达,黏膜固有层的IFN-γ阳性细胞集群分布或沿血管周围密集排布,肌层和肌间存在大量梭形的阳性细胞和串珠状的阳性纤维;IFN-γ阳性产物的相对表达量随着年龄的增长而增加,3日龄和3周龄表达差异不显著(P0.05),11月龄与3周龄鸵鸟表达差异显著(P0.05);不同肠段IFN-γ阳性产物的相对表达量均表现为自十二指肠至空肠的递减趋势,其中3日龄、3周龄鸵鸟各段小肠中差异不显著(P0.05),11月龄鸵鸟空肠中IFN-γ阳性产物的相对表达量较十二指肠显著降低(P0.05),回肠与空肠相比亦显著降低(P0.05)。表明IFN-γ通过多种途径参与鸵鸟小肠的发育和黏膜免疫。     

黄曲条跳甲双孔道钾离子通道基因序列特征及不同组织的表达量分析

昆虫细胞膜钾离子通道与多种生命活动密切相关。结合转录组测序及荧光定量PCR技术,鉴定和分析黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata(Fabricius))钾离子通道基因的序列特征及不同组织器官的mRNA表达谱。结果表明:所获得的钾离子通道蛋白基因(twk)cDNA的开放阅读框为1 137 bp,共编码378个氨基酸残基。蛋白结构分析表明:其含有4个钾离子通道蛋白的跨膜区(M1～M4)和2个孔道结构域(1P～2P),分别位于M1与M2、M3与M4之间,即双孔道钾离子通道。序列保守性分析表明:1P的核心序列为甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸(GYG)模体,2P的核心序列为甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸(GLG)模体。荧光定量PCR分析表明,twk在黄曲条跳甲雌雄成虫的不同部位中都有表达,但是在精巢或卵巢、中肠和头部的表达量相对较高;雌、雄成虫各组织器官之间的相对表达量没有显著差异。     

青鱼γ-干扰素基因的克隆与表达分析

【目的】开展青鱼γ-干扰素(IFN-γ)基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术获得了青鱼(Mylopharyngodon piceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列,然后根据其末端序列设计特异性引物,扩增得到青鱼IFN-γ基因cDNA全长序列,对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析,同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体,将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】青鱼IFN-γcDNA全长为895bp,其开放阅读框大小为549bp,编码182个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示,青鱼IFN-γ与人、鸡、鼠IFN-γ的序列相似性仅为1.5%~7.7%,与其他鱼类IFN-γ序列相似性较高,为16.3%~92.9%。青鱼IFN-γ分子N末端包含1个信号肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青鱼IFN-γ蛋白二级结构与高等脊椎动物IFN-γ类似,包含7个α螺旋结构。经Poly I:C诱导后发现,IFN-γ在青鱼头肾、肾、脾、皮肤和鳃组织中表达显著上调,最高的为头肾,其次为脾、皮肤、鳃和肾,而在心脏和脑组织中无显著变化。青鱼γ-干扰素真核表达质粒在青鱼鳍条组织细胞中成功表达IFN-γ。【结论】成功克隆了青鱼IFN-γ基因cDNA,经Poly I:C诱导后,该基因在头肾中上调倍数最为显著,青鱼γ-干扰素在体外获得表达。     

抗牛IFN-γ单克隆抗体的制备与鉴定

试验以纯化的rHis-BoIFN-γ蛋白为免疫原免疫4～6周龄BALB/c鼠,3次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用纯化的rGST-BoIFN-γ作为检测抗原,以间接ELISA和有限稀释法进行筛选,并初步鉴定其生物学特性。结果表明,试验共获得4株能稳定分泌抗rBoIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚类均为IgM,轻链为κ链;其中腹水效价2株均达到5×104以上;通过Western blot结果表明,4株单抗均可特异性的结合rGST-BoIFN-γ蛋白,而不与GST标签蛋白反应。间接ELISA试验证明,4株单抗只与rBoIFN-γ反应,而不与GST蛋白和rGoIFN-α、rGoIFN-γ、rBoIFN-α等细胞因子发生交叉反应。通过间接免疫荧光显示,4株单抗均与真核细胞BHK21表达的rBoIFN-γ反应产生强荧光反应,证明了单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。阻断ELISA检测结果表明,3D10株单抗能够与牛外周血诱导产生的天然干扰素发生反应,证实了该单抗具有实际的应用价值。     

IFN-γ在大鼠脾脏内的定位研究

观察大鼠脾脏内IFN-γ免疫反应产物的特征与分布。应用免疫组织化学链酶菌抗生素蛋白-过氧化物酶法(Streptavidin-perosidase,SP法),结合葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺呈色。IFN-γ反应产物在大鼠脾脏的小梁、白髓、红髓和边缘区均有分布,证明了脾脏内存在IFN-γ,为“免疫-神经-内分泌网络”提供了形态学依据。     

IFN-γ在大鼠海马内的免疫组化定位

应用免疫组织化学SP法结合葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵呈色法研究IFN-γ免疫反应性产物在大鼠海马内的分布.结果表明,IFN-γ免疫反应主要分布于海马CA1、CA2、CA3区,有少量分布于灰被,齿状回.这为海马具有免疫调节功能的观点提供了新的证据.结合文献,推断IFN-γ在海马-下丘脑-垂体-肾上腺的免疫调控中起主要作用.     

猪IFN-β和IRF-3基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立猪IFN-β及IRF-3基因实时荧光定量PCR检测方法,依据GenBank中IFN-β和IRF-3基因的保守序列,设计并合成各自特异性引物,并以β-actin为内参基因,采用SYBR Green-Ⅰ为染料,建立实时荧光定量检测方法。提取猪肺泡巨噬细胞总RNA,经反转录得cDNA,用特异性引物经PCR扩增得到IFN-β和IRF-3基因,将其克隆至pMD-19T载体,经测序鉴定后得重组质粒,依次10倍稀释做为标准品,建立标准曲线及溶解曲线。结果表明,β-actin基因、IFN-β基因和IRF-3基因标准曲线线性关系较好,R2≥0.997;溶解曲线为特异性单峰,无非特异性扩增,检测下限可达100个拷贝/μL。建立的猪IFN-β和IRF-3基因实时荧光定量RT-PCR检测方法,特异性强、重复性好,为从分子水平上研究猪的免疫应答奠定了基础。     

植物体瞬时表达ChIFN-γ蛋白研究

以生菜、洋葱、萝卜为试材,用转入植物表达载体pSH-NGN的根癌农杆菌EHA 105分别采用真空渗透法和直接注射法瞬时表达ChIFN-γ蛋白,研究其最佳宿主植物和最佳方法.结果显示,真空渗透法和直接注射法在瞬时表达效率上差异不大,真空渗透操作上更简便、更易掌握;新鲜市售生菜,真空抽气25 min,共培养3d,瞬时表达效率达到3 645 pg/g,ChIFN-γ蛋白得到高效表达.     

猪瘟疫苗免疫后IFN-γ水平的检测

［目的］通过检测猪瘟疫苗免疫后的IFNγ水平探讨仔猪细胞免疫情况。［方法］采用超前免疫和普通免疫2种方法对仔猪进行猪瘟免疫,用流式细胞仪对猪瘟疫苗免疫后仔猪外周血单核细胞（PBMC）中分泌IFNγ细胞数量进行检测。［结果］无论采取哪一种方法进行免疫,仔猪PBMC中分泌IFNγ细胞的比例均显著增多,且一直维持在较高的水平。当在60日龄仔猪进行第2次免疫后分泌时,IFNγ细胞的比例增加更为明显,而对照组仔猪分泌IFNγ细胞的比例在试验过程中则一直维持较低的水平,这说明猪瘟疫苗能够诱导仔猪体内IFNγ水平升高,间接表明猪瘟疫苗注射后激发了机体的细胞免疫应答。［结论］与普通免疫方法相比,采用超前免疫方法能够使仔猪及早地产生针对猪瘟的细胞免疫反应。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

多浪羊IFN-γ基因克隆及核苷酸序列分析

为了分析新疆多浪羊的IFN-γ基因,根据GenBank中NM_001009803的mRNA序列设计引物,以新疆多浪羊淋巴细胞的总RNA为模板,用RT-PCR扩增多浪羊IFN-γ基因序列。测序结果表明I,FN-γ基因序列包含了一个582 bp的开放阅读框,通过GenBank中的Blastn序列比较分析,多浪羊的IFN-γ基因与普通绵羊的同源性高达99.82%,为多浪羊IFN-γ的功能研究及多浪羊免疫应答基因的筛选奠定基础。     

甲低大鼠垂体前叶内IFN-γ样免疫反应阳性物质的表达

应用免疫组织化学(SP)法结合H2O2-DAB黄色呈色法进行显色。IFN-γ样免疫反应阳性物质位于细胞的胞浆内,其阳性细胞只分布于垂体前叶,而后叶和中间部未见免疫反应阳性物质;对照组均未发现免疫反应阳性细胞。甲状腺素低下可以诱导大鼠垂体前叶内IFN-γ样免疫阳性物质的表达,提示甲状腺素低下会影响垂体前叶的内分泌功能。