猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别PCR检测方法的建立及初步应用

本试验根据疫苗株缺失gE基因、野毒株和疫苗株均有gB基因的特点,设计两对引物,建立了PCR方法,使用该方法分别对PRV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV进行PCR检测,结果只能从PRV Fa野毒株DNA提取物中扩增出354、237 bp的核苷酸片段,从PRV Bartha-K61疫苗株扩增出237 bp的片段,其他病毒均未扩出条带,达到了区分疫苗株与野毒株的目的。同时,应用该方法对吉林省各大猪场进行了临床病料检测,结果表明,在采集的205份病料中有32份检测为猪伪狂犬病病毒野毒感染,阳性率为15.6%。     

伪狂犬病病毒野毒和疫苗毒双重RPA鉴别检测方法的建立和应用

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒和疫苗毒的快速鉴别检测方法,本研究基于PRV gB和gE基因保守区域设计引物,建立了一种双重重组酶聚合酶扩增方法(RPA)。本研究所建立的双重RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应20min,能够在同一个反应体系中实现对PRV野毒和疫苗毒的特异性鉴别检测,而与其它常见的猪病毒没有交叉反应。所建立的双重RPA方法对PRV gB和gE基因的检测限均为102拷贝,并且与荧光定量PCR方法检测限一致。通过对4株不同PRV株和37份临床样品的检测,结果表明双重RPA方法能够实现对不同PRV株的检测,对临床样品中PRV gB和gE基因的检出率均为45.9%(17/37),与荧光定量PCR方法检测的符合率为100%。本研究所建立的双重RPA方法反应快速、操作简便、结果可靠,可有效应用于对PRV野毒和疫苗毒的快速鉴别检测。     

鉴别伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒与野毒套式PCR方法的建立

为建立一种能够鉴别伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒与野毒套式PCR方法,根据GenBank上发表的伪狂犬病毒gD、gE基因序列,设计并合成了4对引物,对反应体系和条件进行优化,建立复合套式PCR方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料中PRV检测对比等方法验证建立方法的适用性。结果表明,该方法检测的极限为2.78×10~(-4)pg/L,并且仅能从PRV野毒株扩增出354、217 bp目的条带,PRV疫苗扩增出了217bp单条带,其他5种常见感染猪的病毒均为阴性。     

鉴别猪伪狂犬病病毒强弱毒的高效纳米PCR 检测试剂盒及初步应用

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因,用于区分PRV强毒与基因缺失毒株,优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒,对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验,并对临床样品进行检测。特异性试验表明,此试剂盒对于PRV能够扩增出431（gB）、316（gE）和202 bp（gG）的目的片段,对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431和202 bp的目的片段,对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带。敏感性试验表明,此试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100-1000倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到101 copy/μL数量级。试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异,稳定性良好。-20℃至少可保存12个月。在对中国黑龙江、吉林等7个省市的临床送检的117份样品进行检测,结果显示,PRV强毒阳性率为51%,阴性率为49%,未发现有弱毒感染。鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制,对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义,而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断。     

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列，设计了与PRV的gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRVDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为549bp(gB)、429bp(gD)、366bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重PCR扩增，均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明，多重PCR可以检测到106Pg三基因缺失疫苗毒或756PgPRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明，以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增，均无任何条带。     

伪狂犬病病毒gE／gB PCR鉴别方法的建立及其应用

为了检测伪狂犬病病毒(PRV)潜伏感染及确定病毒潜伏的主要部位，建立了能鉴别PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株gE／gB的PCR诊断方法。结果表明，所建立的PCR特异性强、敏感性高、稳定性好，能用于病毒潜伏感染的检测；同时还确定PRV潜伏感染的主要部位是三叉神经节、扁桃体、嗅球、脑干、脑桥和咽黏膜。     

检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。     

区分猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株和野毒株的gE-PCR方法的建立

根据编码猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地从猪伪狂犬病病毒感染的细胞中扩增出预期的178bp片段,而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失株均未扩增出相应的片段,经PCR扩增产物测序鉴定,证实了该扩增片段为预期目的片段;敏感性试验表明,该体系可检测到102TCID50的猪伪狂犬病病毒。本方法的建立能够区分基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪,使猪伪狂犬病病毒的检测更为快速、准确。     

区分猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株和野毒株的gE—PCR方法的建立

根据编码猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地从猪伪狂犬病病毒感染的细胞中扩增出预期的178bp片段,而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失株均未扩增出相应的片段,经PCR扩增产物测序鉴定,证实了该扩增片段为预期目的片段;敏感性试验表明,该体系可检测到10^2TCID50的猪伪狂犬病病毒。本方法的建立能够区分基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪,使猪伪狂犬病病毒的检测更为快速、准确。     

猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的检测

为了检测猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的情况,研究建立了快速,简便,灵敏度高,特异性强的鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪博卡病毒(PBoV)的双重检测方法。针对PRV gE基因和PBoV NS1基因的序列,分别设计了2对特异性引物,通过对引物浓度、模板加入量、退火温度等的优化,建立了快速鉴别PRV和PBoV的双重PCR检测方法,并进行了特异性和敏感性试验。特异性试验表明,该方法可以扩增出PRV gE长度为316 bp和PBoV NS1长度为996 bp的目的片段,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪捷申病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无扩增;敏感性试验表明,PRV、PBoV的最低核酸检出量分别为6.44×10~2拷贝和9.51×10~3拷贝,与单一PCR敏感性相同。应用该方法对49份送检病料样品进行检测,其中PRV和PBoV的单纯感染检出率分别为34.69%和14.28%,混合感染检出率为8.16%,与单一PCR检测结果符合率为93.88%。