菊属与春黄菊族部分属间杂交亲和性初步研究

以菊属植物为母本,通过荧光镜检观察亚菊属、菊蒿属、木茼蒿属、匹菊属、茼蒿属、太行菊属、芙蓉菊属、紊蒿属、滨菊属等近缘属植物花粉在其柱头上的附着与萌发情况,探讨属间杂交亲和性.结果表明,亚菊属、菊蒿属、太行菊属、木茼蒿属、茼蒿属和匹菊属植物花粉可在菊属植物柱头上附着与萌发,属间有一定杂交亲和性,通过常规杂交或结合幼胚拯救方法可能获得远缘杂种;芙蓉菊属、紊蒿属、滨菊属植物与菊属植物杂交不亲和,相互间亲缘关系可能相对较远.     

菊属部分植物的AFLP分析

利用AFLP技术,对菊属植物12个分类群进行分析.选择EcoRI/ MseI 这一酶切组合,5个E+3/M+2引物组合及1个E+3/M+3引物组合进行选择性扩增.共得到287条条带,其中多态性条带占85.7%.利用UPGMA方法对扩增数据进行分析,结果表明:所选的两个栽培品种‘滁菊'和‘亳菊'可归并为一个品种,该品种与毛华菊、野菊、甘菊亲缘关系相对较近,紫花野菊次之,小红菊相对最远.各野生种间,野菊、甘菊和菊花脑间的亲缘关系极近,且同一分布区内的不用种间有比较频繁的种质渗入.研究表明AFLP技术是进行菊属植物亲缘关系研究极为有效的工具.     

部分菊属与亚菊属植物的形态学聚类及亲缘关系分析

对18份菊属植物、2份亚菊属植物及2个两属间杂种的24个形态性状和1个生物学性状进行统计,并对获得的信息数据运用数量分类学聚类方法进行聚类分析.结果表明:Dendranthema arcticum与其他菊属植物的形态相差较大,单独成一类,其他21份材料聚为一类;野菊与菊花腩、异色菊与甘菊、龙脑菊与那贺川野菊两两间形态相似;毛华菊与日本野生菊属植物有较近亲缘关系,日本野生菊属植物较我国野生菊属植物进化;亚菊属矶菊与纪伊潮菊间形态相似,且与菊属植物形态相近,表明两属间有很近亲缘关系.本研究的形态性状聚类结果与传统分类结果基本吻合,表明所涉及的性状指标可以作为菊属系统发生关系研究的有效辅助指标.     

基于PCR-RFLP多态的部分菊属与亚菊属植物亲缘关系研究

运用PCR-RFLP技术对12份菊属与2种亚菊属植物进行了亲缘关系研究。结果发现,菊属与亚菊属植物的rbcL-EcoRⅡ、rbcL-MspⅠ、ndhF-HinfⅠ、petA-MboⅠ酶切片段均无长度多态性,而petA-MboⅡ酶切结果显示A.pacifica、A.shiwogiku的酶切图谱不同于其他菊属植物,表明菊属物种间有很近亲缘关系,且菊属与亚菊属间亲缘关系也很近,但仍存在差异。     

基于rpl16-rpl14、GS序列的广义菊属若干分类群亲缘关系研究

基于叶绿体rpl16-rpl14基因间区序列和GS基因序列对广义菊属(菊科,春黄菊族)部分属间关系进行了探讨。结果表明,本研究涉及的所有分类群均归于一个单系统发生的广义菊属分类群(自展值100%),该单系统发生分类群可进一步分为3个狭义属分类群,即菊属(Dendranthema,自展值96%),菊蒿属(Tanacenum,自展值87%)和木茼蒿属(Argyranthemum,位于广义菊属分类群基部分支)分类群。表明上述基因区段可有效阐明属水平的系统关系。尽管野菊的不同地理居群间或种间在形态学上存在较大差异,但基于上述基因序列未能很好地区别其间的系统发生关系,推测其相互间的基因差异较小。有待于采用多种分子标记对该族更多的分类群展开研究,特别是对属下水平分类群间的系统发生关系进行探讨。     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达。[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a（＋）上构建表达载体,重组质粒转化E.coil BL21（DE3）进行蛋白质表达。[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a（＋）载体上,重组质粒转入E.coil BL21（DE3）后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白。[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础。     

黄颡鱼朗格汉斯细胞的鉴定及其功能基因的表达分析

为研究黄颡鱼朗格汉斯细胞的结构特点以及细菌感染对其功能相关基因表达的影响,采用免疫组化技术对黄颡鱼免疫器官中朗格汉斯细胞进行鉴定,通过透射电镜进一步观察到黄颡鱼朗格汉斯细胞的超微结构,并采用荧光定量PCR检测鲶爱德华氏菌感染后黄颡鱼免疫相关组织内朗格汉斯细胞功能相关基因IL-1β、TNF-α、IL-10和TLR-4的表达情况。结果显示,黄颡鱼头肾和脾脏中具有朗格汉斯细胞的特异性分子标记CD207蛋白,且黄颡鱼朗格汉斯细胞的结构与其他脊椎动物类似,即细胞质中大量的伯贝克颗粒围绕着中心粒呈放射状排列。在鲶爱德华氏菌感染后,朗格汉斯细胞功能相关基因IL-1β、TNF-α、IL-10和TLR-4在黄颡鱼免疫器官内的表达量显著上调。上述结果表明,黄颡鱼含有朗格汉斯细胞,并且其可能参与了机体抗鲶爱德华氏菌感染的免疫反应。     

CYP79B2/B3基因在吲哚族硫苷与IAA代谢中的功能研究进展

吲哚族硫苷与吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,简称IAA)在十字花科植物生长发育和防御过程中发挥了重要作用。CYP79B2/B3基因催化生成的吲哚乙醛肟(IAOx)是这2条代谢途径的共同前体物,因此,阐明CYP79B2/B3基因在吲哚族硫苷与IAA代谢平衡中的作用,对于十字花科植物生长发育调控及病虫害防御研究具有重要意义。本文对吲哚族硫苷合成途径、IAA合成途径及CYP79B2/B3基因在2条代谢途径中的功能研究进展进行了综述。     

黄颡鱼bmp2a与bmp4基因启动子的克隆及分析

为研究黄颡鱼bmp2a与bmp4基因的功能及其相关转录因子的调控网络,采用RLM-5′RACE方法确定bmp2a与bmp4基因的转录起始位点,通过hiTAIL-PCR方法克隆bmp2a与bmp4基因启动子序列并运用生物信息学方法预测启动子序列上的关键转录因子结合位点。结果显示,bmp2a与bmp4基因的转录起始位点分别位于bmp2a与bmp4基因编码区上游的391bp与351bp处。克隆bmp2a与bmp4的1 830bp、1 962bp启动子序列,在启动子序列的基础上预测出AP1、SP1、E-box、GATA1、CREB、PPARγ、SOX5、SOX6和SOX9等转录因子的结合位点,提示这些转录因子对bmp2a与bmp4基因的转录调控发挥潜在的重要作用。     

玉米GRMZM2G455909基因的克隆及其抗病功能初步分析

本课题组前期研究获得玉米GRMZM2G455909基因,该研究拟对GRMZM2G455909基因开展生物信息学分析,明确其分子特征;构建过表达载体pCAMBIA1301a-GRMZM2G455909,通过农杆菌介导法获得转GRMZM2G455909基因拟南芥植株,分析转GRMZM2G455909基因拟南芥植株抗病能力及其抗病信号通路。研究表明,GRMZM2G455909基因所编码的蛋白序列属于NBS-LRR类蛋白家族;Pst DC3000处理转GRMZM2G455909基因拟南芥植株,发现转基因植株体内菌体数量明显下降,其抗病性显著增强,推测Pst DC3000可能诱导转GRMZM2G45590基因拟南芥体内形成水杨酸抗病信号通路。研究结果可为作物遗传育种抗病性的改良提供新的路径。     

甘菊内参基因CITUA的克隆与表达分析

根据前期工作已获得的甘菊α-tubulin基因EST序列,使用RACE技术获得了该基因的全长序列,命名为ClTUA。生物信息学分析表明,ClTUA基因全长cDNA序列为1 580 bp,编码432个氨基酸残基。利用MEGA40软件对推测的氨基酸序列进行系统关系分析发现,其为植物中Ⅰ类α-tubulin基因。RT PCR分析发现:ClTUA基因不仅在盐、干旱、冷、热、脱落酸和水杨酸各种非生物胁迫下稳定表达,而且在不同生长发育阶段的样本中稳定表达;而作为对照的两个内参基因,ClActin和26S rRNA基因在不同非生物胁迫下表达稳定,但在不同生长发育阶段的样本中表达强度不同。这一结果表明,ClTUA基因的表达稳定性优于ClActin和甘菊26S rRNA基因,可以作为内参基因用于甘菊抗逆性和生长发育过程中基因表达规律研究。      

菊花几丁质酶基因ChCHI的克隆及表达分析

根据GenBank发布的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因ChCHI(GenBank登录号为KX881373)。ChCHI基因cDNA全长为1 385 bp,包含960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸。ChCHI属于亲水性蛋白,相对分子质量约为35.5 k D,等电点为6.38,为稳定蛋白,二级结构预测表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。蛋白序列比对和进化树分析表明,ChCHI基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族几丁质酶,与薇甘菊(ACO25187.1)几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,序列一致性为87%。qRT-PCR分析结果显示,SA处理可以明显提高贡菊叶片中ChCHI的表达量。菊花ChCHI在对抗环境胁迫的分子调控中起重要作用。     

杭白菊成花期内源激素及相关基因的动态变化

以'早小洋菊'和'晚小洋菊'为试材,测定2个品种的在成花期的5种内源激素的含量及其相关基因的表达量,对花芽分化和花器官发育期间茎尖、茎段和叶片3个部位中内源激素的变化、运输和作用进行研究.结果显示:在花芽分化期,茎尖GA和ABA含量增加显著,IAA维持高浓度状态;随着花器官的发育,IAA含量最早出现下降,ABA和GA则下降较晚.不同器官内GA含量的差异性与CmGA20ox基因表达量上调的一致性的特殊现象,揭示GA部分在叶片中合成后向茎尖富集的运输现象;所有部位IAA含量增加,但后期仅茎尖YUC基因合成上调,可猜测IAA表现为茎尖富集一段时间后向下运输,NVCED表达变化显示ABA也可能存在茎尖富集的现象,但仍需进一步研究.可见适宜浓度的GA、ABA和IAA有利于菊花的花芽分化和花器官发育,高浓度ABA可使胞间连丝闭合阻碍IAA的输出和GA输入,这可能是延迟'晚小洋菊'开花的最主要因素.     

中间锦鸡儿FAD2基因拷贝数检测及组织表达谱分析

【目的】探索中间锦鸡儿基因组中FAD2基因的拷贝数,分析不同拷贝的表达模式,以期揭示不同拷贝在植物体内的功能分工。【方法】根据中间锦鸡儿(Caragana intermedia)FAD2基因的保守序列设计1对引物SF和SR,利用该引物对PCR扩增制备114 bp的Southern检测探针,探针进行地高辛标记后,采用罗氏Southern杂交试剂盒进行Southern检测。根据中间锦鸡儿3个FAD2基因各自的特异差异序列,分别设计定量PCR引物序列,以actin基因为内参,对中间锦鸡儿的根、茎、叶及不同发育时期(发芽15,25,35 d)种子的cDNA进行定量PCR分析。【结果】中间锦鸡儿FAD2基因至少有4个拷贝,且不同拷贝的表达模式不同。FAD2-2A基因在根和发育中期、后期的种子中低水平表达,在幼嫩的茎、叶以及发育早期的种子中高水平表达;FAD2-1A基因在根中的表达量最低,在种子发育早期、中期大量表达,在幼嫩叶子中表达水平也较高;FAD2-1B基因仅在种子发育中期大量表达,在其他组织及种子其他发育阶段的表达量均保持在本底水平。在不同组织以及种子的不同发育时期,FAD2-1A相对表达量的变化幅度最大,达到了近100倍,FAD2-1B次之,FAD2-2A最小。【结论】结合序列比对分析推测:FAD2-2A基因可能主要负责合成膜脂中的亚油酸,FAD2-1A主要负责种子及叶子贮脂中亚油酸的合成,FAD2-1B负责种子贮脂中油酸的去饱和作用。     

果梅PmKNAT2基因全长cDNA克隆及表达分析

【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并对其结构特征及表达模式进行分析,为研究果梅雌蕊败育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2（KNAT2的同源基因）序列（EF093491）,根据桃的KNOPE2序列设计特异引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA;通过RT-PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长;使用DNAMAN软件进行序列拼接;利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;通过生物信息学方法分析结构特征;用DNAMAN软件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0软件进行系统进化树的构建;利用Bioxm2.6推测分析蛋白分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用ExPaSy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;构建PJIT166-PmKNAT2-GFP的融合亚细胞定位表达载体,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞,经暗培养后在激光共聚焦显微镜下观察;利用实时荧光定量RT-PCR研究其表达模式,分析其在‘大嵌蒂’花芽发育不同时期、不同器官中的表达特性。【结果】在‘大嵌蒂’果梅中获得一个KNAT2的同源基因,命名为PmKNAT2,其cDNA全长为1 402 bp,5'UTR 47 bp,3'UTR 293 bp,编码区全长为1 062 bp,编码353个氨基酸,预测蛋白质分子量为40.41 kD,理论等电点为4.85。蛋白结构分析表明该基因编码的氨基酸具有2个结构域,MEINOX结构域（KNOXⅠ和KNOXⅡ 2个亚结构域）和HD（homomeodomain）结构域,属于KNOX蛋白;相似性分析发现该基因与GenBank中其它来源的KNOX蛋白序列的相似性为50%-100%;系统进化树分析显示果梅PmKNAT2与桃KNOX聚为一类,表明与其亲缘关系最近。二级结构预测结果表明PmKNAT2所编码蛋白由47.14%的α-螺旋（Alpha helix）、3.43%的β-转角（Beta turn）、3.14的β-折叠（Extended strand ）和46.29%的随机卷曲（Random coil）组成。亚细胞定位结果显示该基因编码的蛋白定位于细胞核和细胞膜中。实时荧光定量RT-PCR分析表明,在‘大嵌蒂’果梅不同时期花芽中PmKNAT2的表达量存在一定差异,PmKNAT2在11月份的表达量最高,9月、10月和11月的表达量差异不明显,但与12月和1月花芽中的表达量差异明显;生长素在1月份含量最高,9、10、11月份差异不明显,其含量变化趋势与PmKNAT2表达趋势相反。对该基因表达量最高的11月份的花芽进行实时荧光定量分析发现：PmKNAT2在各种花芽中均有表达,在不完全花（雌蕊褐色、雌蕊畸形和无雌蕊）中的表达量高于完全花（雌蕊正常）。进一步分析PmKNAT2在完全花与不完全花的不同花器官中的表达量,结果表明PmKNAT2在完全花与不完全花的各部位的表达量趋势相似均为：萼片>雄蕊>花瓣,在完全花雌蕊中的表达量最低。【结论】推测PmKNAT2在雌蕊发育阶段的异常表达可能与‘大嵌蒂’果梅雌蕊败育有关。     

文冠果FAD2的序列与功能分析

脂肪酸脱饱和酶2(fatty acid desaturase 2, FAD2)基因是油脂合成代谢的关键酶基因,其编码的蛋白催化油酸(18∶1)进一步脱饱和形成亚油酸(18∶2)。本研究以富含油酸和亚油酸2种优质不饱和脂肪酸的文冠果种胚为试材,采用简并引物策略结合RACE技术,克隆了文冠果FAD2的cDNA序列。序列分析表明,文冠果FAD2除具有植物FAD2特有的3个组氨酸区和N端的芳香族氨基酸区外,还具有3个N—糖基化位点和多个磷酸化位点。通过农杆菌介导,将文冠果FAD2转入拟南芥fad2突变体中进行表达分析。气相结果表明,拟南芥fad2突变体缺失亚油酸,而转入文冠果FAD2的拟南芥fad2突变体的种子油中产生了亚油酸,这表明所克隆的文冠果FAD2基因编码的酶具有催化油酸(18∶1)脱饱和成为亚油酸(18∶2)的活性。      

舞毒蛾LdGSTe1基因的克隆及表达

从舞毒蛾(Lymantria dispar)3龄幼虫转录组文库中鉴定获得舞毒蛾谷胱甘肽S–转移酶基因全长c DNA,命名为Ld GSTe1。该基因全长651 bp,编码216个氨基酸。序列分析显示,Ld GSTe1蛋白氨基酸序列含有GST_C_Delta_Epsilon与GST_N_Delta_Epsilon 2个保守结构域,属于类硫氧还蛋白和谷胱甘肽S–转移酶2个超家族。系统进化树分析表明,舞毒蛾Ld GST蛋白属于GST Epsilon家族。蛋白结构显示,Ld GSTe1蛋白包含一个N端和一个C端结构,α–螺旋与β–折叠为主要结构元件。实时荧光定量PCR结果表明,在4.0、10.0 mg/L鱼藤酮药剂处理下,舞毒蛾3龄幼虫Ld GSTe1基因表达先下降后上升,推测该基因参与舞毒蛾解毒应答。     

毛竹早期光诱导蛋白基因克隆及功能分析

  目的  探究早期光诱导蛋白(ELIP)基因在竹子光保护中的作用,为进一步阐述竹子光保护机制提供参考依据。  方法  以毛竹Phyllostachys edulis实生苗为材料,在前期研究的基础上克隆毛竹ELIP基因,利用qRT-PCR技术研究其在不同光照诱导下的表达谱,同时通过在拟南芥Arabidopsis thaliana中异位表达对1个基因的功能进行初步鉴定。  结果  克隆获得了3个毛竹ELIP基因(PeELIP1、PeELIP2和PeELIP3),分别编码165、179和182个氨基酸。蛋白结构分析表明:3个PeELIPs蛋白均具有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,含3个α-螺旋跨膜结构,属于叶绿素a/b结合蛋白超家族。序列比对及进化分析表明:PeELIPs与水稻Oryza sativa、玉米Zea mays等单子叶植物的ELIPs相似性较高,同源性达72%以上,聚类在同一分支。qRT-PCR分析表明:3个PeELIPs基因在毛竹黄化苗中仅检测到微弱表达,光照处理使3个基因的表达量均显著上调;同时在正常毛竹实生苗叶片中,随着光照强度的增强和强光胁迫处理时间的延长,3个PeELIPs基因的表达量都显著上调。过表达PeELIP3可减缓转基因拟南芥在强光下F_v/F_m的下降幅度,但未影响转基因植株的非光化学猝灭系数。  结论  毛竹中至少存在3个PeELIPs,且其表达均受光照的诱导。过量表达PeELIP3能够减缓转基因拟南芥受光抑制的程度,具有一定的光保护作用。图8表1参40     

芍药内外花瓣发育形成相关基因片段的生物信息学及组织表达分析

为揭示芍药内外花瓣形成的分子机制,以托桂型芍药品种‘紫凤羽’为材料,利用转录组测序筛选调控芍药花型发育的关键基因序列片段,首先通过生物信息学方法分析基因片段的蛋白结构与功能以及亚细胞定位,其次利用qPCR检测基因在花瓣中表达情况。结果显示,测序筛选出2个关键基因——AGAMOUS(AG)和MADSbox protein2(MADS2),蛋白分析表明两者均为脂溶亲水性不稳定蛋白,均无剪切信号肽和跨膜结构,为非分泌蛋白,二级结构均以α螺旋(Alpha helix)为主,三维结构模型极为相似,并且包含1个相同的保守功能域—MADS,很少信号肽分泌途径上;qPCR检测显示内瓣AG与MADS2表达量均极显著高于外瓣(P0.01)。芍药AG和MADS2蛋白结构功能、表达水平差异均存在一定的相似性,推测两者可能在芍药花瓣形成过程中发挥相同的生物学功能。