朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨V-ATP酶H亚基基因克隆及特征分析

【目的】为了寻找有效防治朱砂叶螨的生物学方法。【方法】克隆朱砂叶螨V-ATPaseH基因,对该基因序列进行生物学特征分析;采用实时荧光定量PCR技术对V-ATPaseH进行不同时期表达特征分析。【结果】成功克隆V-ATPaseH基因(GenBank登陆号：OQ834270),基因全长1 540 bp,阅读开放框为1 475 bp,编码491个氨基酸;V-ATPaseH在朱砂叶螨的卵、幼螨、若螨、成螨4个时期均有表达。其中以朱砂叶螨成螨时期表达量最高,其次是若螨、卵,幼螨时期表达量最低。【结论】克隆得到朱砂叶螨V-ATPaseH基因,明确其不同时期的表达特征,为今后研究以V-ATP酶为靶标的新型生物农药杀螨剂研制奠定基础。     

朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3基因克隆及表达特征分析

[目的]拟克隆朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3并对其进行表达特征分析.[方法]采用同源基因克隆技术克隆TecCDA3,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达特征.[结果]成功克隆朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3 (GenBank No.MK779705),其开放阅读框长度为1 611 bp,共编码536个氨基酸,含有3种结构域,根据同源性和发育树分析判定其属于几丁质脱乙酰基酶家族Group Ⅱ.TecCDA3在成螨时期表达量最高,在幼螨时期表达量最低,呈现先下降后升高的表达趋势.[结论]克隆得到朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3并对其表达特征进行分析,丰富朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶基因家族.     

朱砂叶螨黄素单加氧酶TcFMO5基因克隆及表达

【目的】为了找到有效防治朱砂叶螨的生物学方法。【方法】克隆朱砂叶螨黄素单加氧酶TcFMO5基因，对其序列进行特征分析；通过实时荧光定量PCR技术分析TcFMO5在不同发育时期的表达规律。【结果】成功克隆TcFMO5基因(GenBank登陆号：OP901690),全长1 397 bp,阅读开放框1 302 bp,编码433个氨基酸；TcFMO5在朱砂叶螨的卵、幼螨、若螨、成螨四个时期均有表达。其中卵时期表达量最高，成螨时期其次，幼螨和若螨时期表达量较低。【结论】克隆得到TcFMO5基因，明确其不同时期的表达特征，为今后研究黄素单加氧酶的生理功能及以其为靶标的新型杀螨剂研制奠定基础。     

中国水仙几丁质酶基因的克隆与表达分析

【目的】克隆中国水仙几丁质酶基因,分析其在水仙不同组织中的表达,为提高中国水仙的抗病性提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆得到中国水仙几丁质酶基因,对其序列及编码氨基酸序列进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析该基因在感染基腐病、病毒病及褐斑病中国水仙根、叶中的表达。【结果】中国水仙几丁质酶基因的cDNA序列长768bp,编码230个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为25.4ku,理论等电点为9.04,为不稳定蛋白,亲水性强,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该基因编码的蛋白与荷兰芹几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,隶属于糖苷水解酶19家族,与溶菌酶相似超家族基因的保守结构域类似,推测其可能是兼具几丁质酶和溶菌酶的双功能酶。qRT-PCR分析表明,在水仙基腐病、病毒病及褐斑病发病过程中,水仙几丁质酶基因的表达量均显著提高。【结论】成功克隆得到中国水仙几丁质酶基因,推测该基因可能参与了水仙的抗病过程。     

朱砂叶螨精氨酸激酶基因的克隆与表达特征

【目的】拟克隆朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)精氨酸激酶基因,并分析其序列特征及表达模式,探讨该基因在朱砂叶螨生长发育、滞育及响应温度胁迫和紫外胁迫等方面的作用。【方法】通过RT-PCR技术和RACE方法,获得朱砂叶螨精氨酸激酶cDNA全长序列(TcAK),并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测TcAK基因在不同发育阶段、滞育状态和温度胁迫及紫外胁迫条件下的表达情况。【结果】结果表明,TcAK基因阅读框架全长1 071bp,编码356个氨基酸残基,含有典型的精氨酸激酶活性中心位点和底物结合区。TcAK基因在幼螨期和若螨期的表达量较卵期显著增大,在幼螨期的表达量达到最大,远高于其他发育阶段,而TcAK基因在成螨期的表达量较卵期下降。此外,滞育状态、高温/低温胁迫、UV胁迫下朱砂叶螨的TcAK表达量均显著升高。【结论】朱砂叶螨精氨酸激酶与其生长发育相关,并可能参与抵御外界不良环境。     

番茄WRKY转录因子基因片段的克隆及序列分析

【研究目的】本研究以番茄苗为实验材料,克隆出番茄WRKY转录因子的一个基因片段并对其核酸序列进行分析。【方法】根据本课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物,利用RT-PCR技术获得番茄WRKY转录因子的一个基因片段并连接到pMD19-T载体中,转化DH5α,,筛选阳性克隆,用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。【结果】结果表明,克隆获得的WRKY转录因子基因片段约为680bp,用GenBank中的Blastn程序分析表明,其与CaWRKY（AY789641.1）、WIZZ（wizz mRNA）（AB028022.1）的相似性分别为86％和84％。【结论】WRKY转录因子在番茄中受JA诱导,这为克隆番茄WRKY基因全长,进而为番茄抗病育种奠定基础。     

哈茨木霉几丁质合酶基因ThChsC的克隆及序列分析

 【目的】克隆哈茨木霉几丁质合酶基因全序列,并对序列进行生物信息学分析。【方法】利用多聚酶链式反应（PCR）和染色体步移技术（genome walking）克隆几丁质合酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,对蛋白质的三维结构进行预测。【结果】从哈茨木霉（Trichoderma harzianum Th-33）中扩增得到几丁质合酶基因ThChsC（GenBank登录号HQ419000）,编码区（CDS）长为2 835 bp,由4个外显子和3个内含子组成,开放阅读框（ORF）长2 688 bp,编码895个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该基因与串珠状赤霉（Gibberella moniliformis,ACY08039.1）和禾生刺盘孢菌（Colletotrichum graminicola,AAL23718.1）几丁质合酶基因相似性最高,分别为80%和81%;相应的氨基酸序列同源性均为80%,系统进化分析表明,ThChsC属于III型几丁质合酶亚家族。几丁质合酶ThChsC含有1个Chitin_synth_1结构域,1个Chitin_synth_1N结构域,1个Chitin_synth_2结构域,3个跨膜结构域,不含信号肽,为膜结合蛋白。对预测的三维结构分析表明,ThChsC含有糖基转移酶的保守DHD结构域。【结论】从哈茨木霉Th-33中克隆得到几丁质合酶基因ThChsC,对该基因的深入研究有助于探索哈茨木霉几丁质合成的机制。     

朱砂叶螨谷氨酸门控氯离子通道GluCl1基因的克隆与序列特征分析

朱砂叶螨是一种分布广泛、危害极大、难以防治和易产生抗性的农业害螨。为了研究朱砂叶螨杀螨剂神经靶标谷氨酸门控氯离子通道,进一步确定阿维菌素对朱砂叶螨的抗性机理,采用同源基因克隆以及RACE技术,克隆朱砂叶螨杀螨剂靶标谷氨酸门控氯离子通道(GluCl1)基因全长,分析其序列特征。结果表明,GluCl1基因序列全长为1856 bp,其中开放阅读框(ORF)为1338 bp,编码455个氨基酸,N端含25个氨基酸的信号肽,有4个跨膜结构域,GenBank登陆号为KC543353。同源比对分析表明,朱砂叶螨与其他蜱螨目GluCl基因有高度的同源性,特别与二斑叶螨的相似度最高。研究还发现朱砂叶螨敏感品系GluCl1第3个跨膜区的G314,与二斑叶螨敏感品系相应位点的氨基酸G323一致,而二斑叶螨抗性品系相应位点突变为D323。本研究进一步证实了G323突变为D323和二斑叶螨对阿维菌素产生抗性有关。本研究为今后建立以朱砂叶螨谷氨酸门控氯离子通道为靶点的选择性杀螨剂体外筛选体系奠定坚实基础。     

BtR05对朱砂叶螨的致病性及其制剂的毒力测定

[目的]为研究开发苏云金芽孢杆菌杀螨剂提供借鉴。[方法]使用BtR05菌株对朱砂叶螨进行致病性研究,确定其杀螨活性后,制备了BtR05悬浮剂,并使用该悬浮剂对朱砂叶螨的幼螨、若螨和成螨进行了室内毒力测定。[结果]稀释500倍以下的浓度对朱砂叶螨的毒杀效果较好,在药后96h幼螨的校正死亡率均达到80％以上,若螨的校正死亡率均达到75％以上,成螨的校正死亡率均达到60％以上,表明BtR05悬浮剂对朱砂叶螨的幼螨、若螨和成螨均具有毒杀作用。BtR05悬浮剂与对照药剂金维达相比,悬浮荆稀释300倍以上对幼螨和若螨的毒杀作用在药后96h差异显著,说明BtR05悬浮剂的持效性高于对照药剂。[结论]苏云金芽孢杆菌BtR05悬浮剂对朱砂叶螨的幼螨、若螨和成螨均具有毒杀作用,并且其持效性明显高于对照药剂金维达。     

二斑叶螨几丁质酶基因的克隆及特性分析

几丁质酶广泛存在于自然界的许多物种,并参与几丁质降解、蜕皮、免疫和致病性等诸多功能.采用同源克隆结合RACE-PCR的方法,首次从螨类中克隆到二斑叶螨几丁质酶基因(TuChi)的cDNA全长序列(GenBank登录号:JQ041366).TuChi全长1 822 bp,包含3'非翻译区(UTR)为150 bp和5'UTR为52 bp,开放阅读框(ORF)为1 620 bp,编码539个氨基酸.预测的相对分子量为60.7 ku,理论等电点为5.99.二斑叶螨几丁质酶具有几丁质酶典型的结构域,包括1个N-端信号肽序列、1个几丁质催化区域、1个几丁质结合域,以及连接催化区和结合域之间的连接区域.与其他物种几丁质酶进化树比较分析表明,TuChi与昆虫几丁质酶家族Group 1具有较高的同源性,推测其与二斑叶螨的蜕皮密切相关.     

放线菌Lj20发酵液杀虫活性的研究

[目的]为抗生素类药剂的开发和合理使用提供参考。[方法]从辣椒根部分离得到植物内生放线菌Lj20,研究其发酵液对小菜蛾幼虫、朱砂叶螨成螨及产卵的杀虫活性。[结果]处理24 h后,植物内生放线菌Lj20的发酵原液对小菜蛾幼虫的选择性拒食率、非选择性拒食率分别为95.45%9、7.84%,处理48 h后分别为81.55%、96.51%;对朱砂叶螨成螨的校正死亡率最高,为54.51%,随着稀释倍数的增加,校正死亡率逐渐降低。发酵原液和不同稀释倍数的发酵液对朱砂叶螨都具有较强的产卵忌避活性,处理24 h后原液的产卵忌避率高达90.24%。[结论]植物内生放线菌Lj20的发酵液对小菜蛾幼虫有较强的拒食作用,对朱砂叶螨有较强的触杀作用和产卵忌避作用。     

气单胞菌几丁质酶的产酶条件优化研究

[目的]为了进行气单胞菌几丁质酶产酶条件的研究。[方法]从自然死亡家蚕中肠围食膜中分离的气单胞菌进行产酶优化试验。其优化条件为:粉状几丁质1.2%,K2HPO4 0.12%,乙酸铵0.02%,发酵72 h,温度为30℃,起始pH值为8.0,培养基装量为15%。[结果]结果表明:该菌株所产几丁质酶的最适反应温度为25℃,pH值5.5,耐温性较差,但pH值5.0～9.0的酶活力较稳定(>88%)。[结论]该研究提供了提高几丁质酶产量的途径,但对该菌株进行基因改造或诱变育种,充分发掘其产酶潜力,对其几丁质酶基因进行克隆、表达等仍需进一步研究。     

Biochemical Evidences for Scopoletin Inhibits Ca~(2+)-ATPase Activity in the Carmine Spider Mite,Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)

[Objective] This study aimed to investigate the acaricidal effect of scopoletin, and provide the biochemical evidences of scopoletin influences Ca2 +-ATPase activity and gene expressions in the Carmine Spider Mite, Tetranychus cinnabarinus.[Method] The acaricidal effects of scopoletin were investigated by slip-dip method.Exposeed to different concentrations of scopoletin(0.16-2.5 mg/ml), Ca2+-ATPase activity in vivo and protein contents were investigated. For assessing the in vitro effect, Ca2+-ATPase enzyme(200 μl) prepared from normal mites were incubated with different concentrations of scopoletin reagents. [Result] Scopoletin exhibited significant inhibitory effect on Ca2+-ATPase activity both in vivo and in vitro, and resulted in increased protein contents; kinetic analysis showed that the catalytic capability of Ca2+-ATPase was significantly reduced by scopoletin. [Conclusion] Scopoletin exhibits a significant inhibitory effect on Ca2 +- ATPase, and its acaricidal effect against T. cinnabarinus might be due to the direct inhibition of Ca2+-ATPase.     

华山松疱锈病的重寄生真菌(深绿木霉)中几丁质酶基因cDNA片段的克隆

[目的]分离深绿木霉S5003中的几丁质酶基因,为获得高抗病的转基因植株奠定基础。[方法]采用华山松疱锈病的锈孢子壁作为诱导物,诱导深绿木霉SS003中几丁质酶基因的表达,并通过lit—PER方法扩增得到几丁质酶基因片段。[结果]锈孢子壁可诱导出高活性（40．17μg／10min）的几丁质酶,PCR扩增得到了长度为834bp的特异片段,经序列测定及分析显示该片段为几丁质酶基因片段。[结论]深绿木霉SS003的几丁质酶基因片段的获得,为分离全长基因以及进一步利用该基因生产几丁质酶以及进行基因转化提供了可能。     

朱砂叶螨不同侵染时间对木薯生理指标的影响

[目的]探讨不同木薯品种在朱砂叶螨刺吸胁迫下的生理生化指标变化,为木薯的抗螨品种选育提供理论依据.[方法]田间调查华南8号、南植199和华南205等3个木薯品种朱砂叶螨的种群数量;采用盆栽法比较接螨叶片(处理)与健康叶片(对照)的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和丙二醛(MDA)含量及超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性等生理生化指标差异.[结果]不同木薯品种的朱砂叶螨种群数量在调查期内同时出现一个高峰(10月30日左右),其中华南205朱砂叶螨高峰期种群数量最多(105.6±6.9头/叶),其次为南植199(53.2±8.6头/叶),华南8号种群数量最少(38.7±3.8头/叶).朱砂叶螨为害后,3个木薯品种叶片的叶绿素含量与同期对照相比均降低;叶片可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸和MDA含量与同期对照的比值整体上呈先升高后降低的变化趋势,SOD和POD活性整体上有升高趋势.其中抗螨品种华南8号的可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量及SOD和POD活性与同期对照的比值上升幅度较大,感螨品种华南205的上述生理指标较同期对照升高幅度较小.[结论]在朱砂叶螨刺吸胁迫下,不同木薯品种的叶片可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量及SOD和POD活性存在显著差异,初步推测这几项生理指标变化可作为鉴定木薯品种抗螨性强弱的依据.     

木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯

[目的]为木霉几丁质酶和几丁寡糖的开发应用提供必要的技术支持。[方法]由高产几丁质酶的木霉菌株YHS-1液体振荡培养得到木霉几丁质酶粗酶液,分别测定了木霉菌株YHS-1在不同时间、不同温度下的几丁质酶活值,优化木霉产酶条件。并研究了几丁寡糖的制备及提纯方法。[结果]供试木霉最佳产酶温度为35℃,最佳产酶时间为4 d,此时酶活值为55 U。几丁质酶粗酶液通过(NH4)2SO4分级沉淀、阴离子交换柱层析、SDS-PAGE提纯后可以达到层析纯,出现单一并且峰值很高的层析峰,电泳确认2条带,分别为几丁质外切酶和几丁质内切酶。几丁寡糖用初提纯的几丁质酶与过量的胶态几丁质反应得到粗溶液,再经过蛋白质沉淀和冷冻离心后得到纯化。[结论]建立了木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯方法,为木霉几丁质酶和几丁寡糖的开发应用提供了必要的技术支持。