猪肺炎支原体PCR检测方法的建立与应用

根据猪肺炎支原体(Mhp)的P36基因的核苷酸序列,设计一对引物,建立一种猪肺炎支原体PCR检测方法,此方法对对照菌株显示为阴性,对猪肺炎支原体的扩增结果显示为阳性,并对此方法进行了特异性和敏感性试验,结果成功建立了猪肺炎支原体特异且敏感的PCR检测方法。采用已经建立的PCR方法对18份疑似猪支原体肺炎(MPS)样品进行检测,发现有9份呈现阳性,占比50%。试验结果表明,建立的该PCR检测方法可用于猪支原体的临床诊断,能为其以后的防控提供有力依据。     

猪肺炎支原体PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪肺炎支原体P36基因序列,设计1对引物,建立了猪肺炎支原体PCR诊断方法,该方法对猪肺炎支原体的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪肺炎支原体检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测52份猪肺炎支原体疑似病料,检出阳性病例18份,以上结果表明该PCR方法特异性强敏感性高、简便、快速,可用于猪肺炎支原体疾病的诊断。     

一株猪肺炎支原体的分离鉴定

从全国部分猪场采集到疑似猪支原体肺炎肺组织病料12份,提取DNA进行猪肺炎支原体PCR和多重PCR检测,将病料研磨后分离猪肺炎支原体,最终分离到1株疑似猪肺炎支原体;通过测序分析、形态观察、生化试验、血清学试验证实其为猪肺炎支原体。该菌株能适应人工培养基的培养,且传代生长良好,液体培养基中培养活菌滴度达109CCU/m L;菌株有一定的致病性,免疫原性好,可作为疫苗备用菌株,该菌株的分离鉴定为研制猪支原体肺炎疫苗奠定了基础。     

湖南省部分地区屠宰猪猪肺炎支原体感染率调查

用PCR方法对来源于湖南省株洲市、益阳市、长沙市、岳阳市、邵阳市、衡阳市等6个地区部分规模猪场的322份屠宰猪肺样品进行猪肺炎支原体检测。结果发现,猪肺炎支原体在该地普遍存在,检出率分别为:株洲市19.2%(11/57),益阳市18.1%(8/44),长沙市20.0%(13/65),岳阳市17.5%(7/40),邵阳市23.2%(13/56),衡阳市25.0%(15/60)。序列分析表明,试验的PCR产物与国内已出版的相关序列分别有98%~100%的同源性。试验结果证实了猪肺炎支原体在湖南省规模化猪场不同程度存在,对湖南省防控猪支原体肺炎提供了数据参考。     

用PCR检测长沙市猪肺炎支原体和猪鼻支原体的感染情况

为对长沙市猪支原体肺炎病原流行病学进行初步调查,用PCR方法对从湖南省长沙市5个县（市、区）205头猪中收集的326份病料（205份猪肺和121份猪鼻拭子）分别进行了猪肺炎支原体和猪鼻支原体检测,并对部分基因进行了序列分析。结果发现,猪肺炎支原体检出率为24.4%（50/205）,猪鼻支原体检出率为22.3%（27/121）;长沙市每个县（市、区）的生猪中均存在这两种支原体,其中长沙县生猪阳性率最高（42.4%和31.5%）;序列分析表明,检测出的基因序列与国内外相关序列有97%～100%的同源性。本试验证实了猪肺炎支原体和猪鼻支原体在长沙市猪场的存在。     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体在屠宰猪呼吸道与血液中的分布

用PCR方法对从湖南省长沙市515头屠宰猪收集的1 204份样品(120份猪鼻拭子、254份猪支气管拭子、515份猪支气管肺泡灌洗液和235份猪肺、80份血液)进行了猪肺炎支原体和猪鼻支原体检测,并对部分PCR产物进行序列分析。结果发现,猪肺炎支原体在猪支气管灌洗液中检出率最高(23.3%,120/515),猪鼻拭子和血液中检出率最低(0);猪鼻支原体在猪鼻拭子中检出率最高(24.3%,125/515),在猪支气管拭子中检出率最低(2.5%,3/120)。序列分析表明:试验的PCR产物与国内已出版的相关序列有97%~100%的同源性。试验探明了猪肺炎支原体和猪鼻支原体在猪呼吸道与血液中的分布情况,为这两种支原体的分离鉴定提供了依据。     

苏姜猪肺炎支原体流行病学调查报告

为研究苏姜猪新品种对猪气喘病的抵抗力,笔者采集不同猪场各个生长阶段苏姜猪的鼻拭子,采用PCR检测肺炎支原体病原携带的差异性。试验结果显示,不同猪场间猪群肺炎支原体病原携带的阳性率存在差异;猪群生长发育的不同时期,肺炎支原体病原携带的阳性率也存在差异(育肥期最高);苏姜猪携带肺炎支原体比其亲本姜曲海猪携带病原的阳性率低。结果说明了猪场猪群肺炎支原体病原阳性率差异与饲养环境相关,苏姜猪比其亲本姜曲海猪对猪支原体肺炎耐受力更强。     

规模化猪场肺炎支原体、鼻支原体与蓝耳病病毒感染情况调查

[目的]为分析猪肺炎支原体(MHP)、猪鼻支原体(MHR)与猪蓝耳病病毒(PRRSV)在临床感染中的相互关系。[方法]对从山东省规模化猪场收集的213份疑似病料进行PRRSV、MHP和MHR的检测,结合猪场的免疫背景对结果进行分析。[结果]发现在猪肺炎支原体免疫猪场,猪肺炎支原体感染比例显著降低,而在猪肺炎支原体非免疫猪场,猪鼻支原体与猪肺炎支原体、猪蓝耳病病毒的混合感染率极高。无论在肺炎支原体免疫场还是非免疫场,猪蓝耳病病毒与猪鼻支原体的混合感染率,都超过了猪蓝耳病病毒与猪肺炎支原体的混合感染率。[结论]PRRSV与MHP和MHR之间有着密切的关系,除猪肺炎支原体外,猪鼻支原体目前已成为危害养猪业的又一重要因素。     

香猪场肺炎支原体感染的血清学调查与分析

猪支原体肺炎又称猪地方流行性肺炎,俗称猪气喘病,是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MH)引起的猪的一种慢性呼吸道传染病.笔者分别于2008年12月份和2009年3月份用猪肺炎支原体抗体检测试剂盒对某香猪场肺炎支原体的感染情况进行了血清学调查,现将调查结果报道如下.     

香猪肺炎支原体抗体水平的固相ELISA方法检测及防治建议

猪肺炎支原体是导致猪呼吸道疾病的重要病原,由此引发的气喘病常给猪场造成巨大的经济损失。了解香猪肺炎支原体感染情况对制定相应科学的防治措施,提高香猪经济效益大有帮助。用固相ELISA方法对香猪肺炎支原体抗体进行检测,采集血清样本97份,经检测阳性45份,阳性率为46．39％。试验结果表明：香猪的阳性率49．06％,杂交猪为43．18％;哺乳仔猪阳性率为0,保育猪为11．11％,育肥猪为59．09％,生产母猪为88．89％。生产母猪和育肥猪已成为香猪场肺炎支原体感染的主要传染源。     

内江猪保种场种母猪肺炎支原体检测

猪肺炎支原体是引起猪支原体肺炎的病原,广泛存在于猪场,猪群一旦感染,很难根除。本试验在内江猪保种场采用鼻拭子PCR和血清ELISA两种方法检测未免疫种母猪的肺炎支原体,结果显示:鼻拭子PCR检测阳性率为5.26%(5/95),血清ELISA抗体阳性率为42.1%(40/95),表明该场种母猪感染猪肺炎支原体的情况比较严重,需进一步采取防控措施。     

猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立一种针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重PCR检测方法.对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、沙门菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌基因组模板进行PCR特异性检测,没有任何非特异性扩增.敏感性试验显示,建立的PCR检测方法能够检测到的PCV2和Mhp模板的最低浓度分别为130和180fg·mL-1.同时用单项PCR和双重PCR对湖北省的各大猪场的174份PRDC样品进行检测,PCV2和Mhp的符合率分别达到100％和98.28％.进一步应用双重PCR调查PCV2和Mhp在不同猪场的感染动态,结果显示有一定比例的仔猪在产房就已经感染PCV2和Mhp,大部分猪是在保育和育肥阶段被感染 ;但是不同猪场表现出不同的感染动态.本试验建立了一种针对PCV2和Mhp的双重PCR检测方法,具有良好的特异性、敏感性,为临床疾病检测和疾病流行态势调查提供了有力的支持.     

绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体双重PCR检测方法的建立及应用

为建立绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的双重PCR检测方法,本试验分别设计了绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的特异性引物,优化反应条件后对其特异性和敏感性进行评价,并对40份鼻拭子进行了检测。结果显示,该方法能同时扩增出绵羊肺炎支原体545 bp和精氨酸支原体806 bp的特异性片段,而对其他病原的DNA扩增均为阴性。该双重PCR方法对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的最低检测限分别为100和10 pg/μL。40份鼻拭子检测结果显示,双重PCR检测方法与分离培养法符合率高达92.5%,均能鉴定出绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体。结果表明,本研究建立的双重PCR方法可用于绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的临床快速诊断。     

新疆北疆部分地区猪支原体肺炎分子流行病学调查

为了解新疆北疆地区猪支原体肺炎的分子流行病学特征,对新疆北疆5个地区的部分规模化猪场进行了调查,采用PCR方法对疑似病料进行了ldh基因检测,将阳性产物测序与在GenBank已登录的标准菌株序列进行同源性分析。结果显示:214份病变肺脏中,阳性病料为122份,阳性率为57.01%(122/214),ldh基因序列与参考菌株同源性为97.3%¹00%。检测结果表明新疆北疆部分地区感染猪肺炎支原体情况比较严重。     

猪气喘病与仔猪副伤寒混合感染的诊治

2017年6月,黑龙江某规模化猪场发生严重呼吸道与消化道疾病。为了探究其发病原因,试验采用病原菌分离及PCR方法对病原进行了鉴定,并针对其进行了药敏试验。结果由发病猪体内分离到沙门氏菌,PCR结果显示该猪场猪气喘病为阳性,药敏试验显示该猪场沙门氏菌对磷霉素、卡那霉素及庆大霉素敏感性较高。该猪场发病病因为猪支原体和沙门氏菌混合感染。本试验结果对临床诊断和治疗提供了参考。     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量PCR检测方法的建立

建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测其敏感性、特异性和重复性。建立的双重荧光定量PCR对猪肺炎支原体和猪鼻支原体的最低检测值均为10copies·μL-1;与猪源致病菌、病毒和其他常见细菌均无交叉反应;各浓度标准品的Ct值变异系数小于5%,重复性好。检测72份临床样本,其中猪肺炎支原体的肺阳性率为80%,鼻拭子阳性率22%,支气管肺泡灌洗液阳性率58.33%;猪鼻支原体的肺阳性率为40%,鼻拭子阳性率66%,支气管肺泡灌洗液阳性率41.67%。建立的双重荧光定量PCR方法比普通PCR更加敏感,实用性强,可用于临床样品的检测。该方法能同时快速和定量地检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体,在短时间内获得样品的多个信息,快速地解决了多次检测所需的时间以及经济消耗,为猪肺炎支原体和猪鼻支原体的监测和防控提供了新型、可靠的检测技术。     

巢式PCR检测猪鼻支原体方法的建立及应用

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasmah yorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法.在特异性检测试验中,设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原体;敏感性试验表明,第1次PCR和第2次PCR的敏感度分别为3.01 mg/L和3.01×10-4mg/L.对41份临床样品肺组织的检测中,普通PCR和巢式PCR的检出率分别为29.3％(12/41)和82.9％(34/41).结果表明,巢式PCR方法明显优于常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性,为猪鼻支原体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术.     

新疆伊宁市周边猪支原体肺炎的流行病学调查

猪支原体肺炎又称猪气喘病,是危害养猪业最重要的疾病之一。本研究通过采集新疆伊宁市周边地区规模化猪场、养殖合作社及生猪散养户饲养的疑似支原体肺炎猪只的鼻拭子或病料(肺脏),利用荧光定量PCR方法对猪支原体肺炎感染情况进行调查,并结合对周边规模化养殖场、养殖合作社和散养户进行的支原体肺炎流行病学调查进行分析,结果显示伊宁市周边规模化养殖场、养殖合作社及周边散养户的猪只均有猪支原体肺炎感染,其中鼻拭子采样阳性率为38.8%;肺脏病料阳性率为57.8%,结果也反映了散养户发生支原体肺炎感染的情况较为严重。同时通过支原体肺炎的流行病学调查结果综合分析该病的发生及发展规律对预防控制新疆地区猪支原体肺炎提供理论依据。     

应用PCR技术鉴定猪鼻支原体的感染

2009年8月份至2010年6月份,广西贵港市、北流市和南宁市3个规模化猪场保育猪陆续出现体温升高、关节肿大、心包炎和腹腔炎等疑似副猪嗜血杆菌病症状,部分病猪发生死亡,为了研究其病原,试验应用PCR技术对病猪肺渗出物和关节液提取的DNA模板进行细菌16S rRNA基因的PCR扩增和测序。结果表明:引起广西省3个规模猪场出现疑似副猪嗜血杆菌病症状的病原是猪鼻支原体。     

贵州猪气喘病的流行病学调查

猪气喘病在我国广泛流行,为查清该病在贵州省流行情况,笔者对部分猪场和散养户进行了流行病学调查,证实猪群咳嗽、气喘现象较为普遍;对疑似病猪、死猪采集病料,用PCR试剂盒检测猪肺炎支原体病原阳性率为25%;对猪群抽检血样,用ELISA试剂盒检测猪肺炎支原体血清抗体阳性率为30%以上。以上调研证明,贵州猪场猪支原体肺炎感染较为严重,这与临床调查结果基本相符。分析原因可能与贵州气候、养猪户不重视保温、绝大多数养猪户不接种猪肺炎支原体疫苗有一定关系,这为今后我省防治该病提供了重要依据。