龟裂链霉菌M527荧光定量PCR内参基因的选择及其稳定性评估

龟裂链霉菌Streptomyces rimosus M527是龟裂霉素（rimocidin）的生产菌，其对多种植物病原真菌具有较强的拮抗作用。为从转录水平分析菌株M527以及其抗性突变株中龟裂霉素的合成调控机制，荧光定量PCR内参基因的选择与稳定性评估显得尤为重要。本研究选用16S rRNA_sr、hrdB_sr、rpoA_sr、sigF_sr、sigB_sr、gyrB_sr这6个基因作为候选内参基因，使用geNorm、NormFinder、BestKeeper三个软件分析在野生型龟裂链霉菌M527、高产龟裂霉素抗性突变株M527-GR7和低产龟裂霉素抗性突变株M527-GR21中候选内参基因的稳定性，筛选出稳定性最高的内参基因。结果显示，sigB_sr基因在菌株M527及抗性突变株M527-GR7和M527-GR21中表达稳定性最好。通过以基因sigB_sr、16S rRNA_sr、rpoA_sr为内参基因，检测龟裂霉素生物合成基因簇中的结构基因rimG_sr在菌株M527-GR7中不同时间的相对表达量，发现基因sigB_sr作为内参基因时能得到更准确的结果。     

稻粒黑粉病菌实时荧光定量PCR内参基因筛选

 实时荧光定量PCR是一种被广泛应用于基因表达研究的分子技术,内参基因的选择对试验结果的可靠性起重要作用。稻粒黑粉病是一种全球性水稻真菌病害,目前没有关于稻粒黑粉病菌内参基因的报道。本文选择6个常用内参基因,对其在稻粒黑粉病菌不同菌株、不同生活史阶段和不同浓度Basta处理3组生物学样本中的稳定性进行比较分析。经geNorm3.5、NormFinder0.953及BestKeeper1.0软件综合评价,结果显示在不同菌株、不同生活史阶段、不同浓度Basta处理生物学样本中,最稳定的内参基因分别为UBQ、GAPDH和EF1α,最优组合分别为UBQ/GAPDH、UBQ/GAPDH和EF1α/GAPDH。本研究结果为稻粒黑粉病菌基因表达研究奠定了基础,同时对其他真菌内参基因的选择提供了参考。     

温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择

 选择合适的内参基因是采用实时定量PCR研究基因表达获得可信数据的关键。以小麦在条锈病菌及温度双因素胁迫为研究对象,采用实时荧光定量PCR评价了CDC、RLI、ACTIN和26S基因的表达情况,采用geNorm和NormFinder软件进行了比较分析。结果表明,小偃6号小麦在常温(15℃±1℃)未接种条锈病菌,以及接种条锈病菌并培育至花斑期分别在高温(20℃±1℃)、变温(20℃到15℃)条件处理中,基因RLI表达不稳定,基因ACTIN在常温条件下以及在条锈病菌及高温处理条件下的表达量相对稳定,但在变温条件下波动较大。表达最稳定的基因是26S,其次是CDC基因,它们可以作为小偃6号-CYR32-温度互作体系中基因表达实时荧光定量PCR研究的内参基因,26S和CDC是最佳内参基因组合。     

刺萼龙葵种子中适宜内参基因的筛选

入侵杂草刺萼龙葵Solanum rostratum Dunal传播扩散的主要载体是种子,研究其种子休眠萌发基因的激素调控对于其防除具有重要意义,而选择合适的内参基因可以提高相关基因表达分析的准确性。本研究以赤霉素、脱落酸和水处理的刺萼龙葵种子为材料,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4种软件对15个候选内参基因进行表达稳定性评价,并通过检测ABI5(abscisic acid-insensitive 5)的表达验证所筛选的内参基因的适用性。结果表明,对于赤霉素、脱落酸和水处理过的种子,最稳定的内参基因分别为eIF(eukaryotic initiation factor)、SAND(SAND protein family)和ACT(β-actin);对所有种子样本而言,PP2Acs(a catalytic subunit of protein phosphatase 2A)是最稳定的内参基因。研究结果将为刺萼龙葵种子休眠萌发的遗传调控研究提供重要参考。     

温度和药剂胁迫下茶刺盲蝽内参基因稳定性分析

为筛选特定条件下实时荧光定量PCR检测体系中能稳定表达的茶刺盲蝽Helopeltis theivora内参基因,从其转录组中筛选并克隆11个候选基因Actin、β-tubulin1、RPL13A、EF1α、RPS3A、GAPDH、18S RNA、G6PDH、EIF4A、TBP和UBQ,测定它们在不同温度及药剂胁迫下mRNA的表达水平,并通过geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct和RefFinder软件(算法)分析各基因的稳定性。结果表明,11个候选基因引物均具有良好的特异性和扩增效率(90.10%～96.87%)。温度胁迫下,EIF4A有最小的平均变异度(mean variability,M)、稳定值(stability value,SV)和几何平均值,分别为0.200、0.096和2.060;RPS3A的平均标准偏差(average of standard deviation,STDEV)最小,为0.605;二者是表达最稳定的基因。药剂胁迫下,RPL13A的M值和STDEV最小,分别为0.123和0.660;RPS3A的SV、标准偏差(standard deviation,SD)和几何平均值均最小,分别为0.063、0.336和1.189;二者是表达最稳定的基因;Actin为最不稳定基因。全样品评价中,RPL13A(M值为0.282、几何平均值为1.565)和RPS3A(SV为0.099、STDEV为0.614)的评价值同比最小,是表达最稳定的基因;最不稳定的基因为Actin、β-tubulin1和TBP。geNorm分析结果还显示所有处理条件下最适内参基因数目均为2个。表明EIF4A和RPS3A可作为茶刺盲蝽与温度相关的抗性基因表达研究的内参基因,RPS3A和RPL13A可作为该虫抗药基因表达研究的内参基因。     

飞蝗前肠最适内参基因筛选

为了筛选在不同发育天数的飞蝗5龄若虫前肠中及其前肠不同部位能够稳定表达的最适内参基因,选用β-肌动蛋白(β-actin)、延伸因子1-α(EF-1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白49(RP49)和α-微管蛋白(α-tubulin)5个基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析各候选内参基因的相对表达量,采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件相结合,筛选出5龄飞蝗前肠不同部位和不同发育天数若虫前肠中的最适内参基因。结果表明,β-actin和α-tubulin为前肠不同部位最适内参基因组合,β-actin、α-tubulin和GAPDH为不同发育天数若虫前肠中最适内参基因组合。本文为飞蝗肠道关键靶基因分子特性及进一步生物学功能研究提供重要理论基础。     

水稻白叶枯病菌室内链霉素抗性菌株的诱导及其抗性分子机制和风险评价

通过紫外光照射诱导获得了6株水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae抗链霉素突变体。测得链霉素对水稻白叶枯病菌敏感菌株ZJ173及其抗性突变体的最低抑制浓度(MIC)分别为0.10和600 μg/mL;对敏感菌株的有效抑制中浓度(EC50)为0.03 μg/mL,对抗性菌株的平均EC50值为11.64 μg/mL,平均抗性倍数为388。通过PCR扩增了敏感菌株ZJ173及5株抗性菌株的rpsL基因(编码S12核糖体蛋白)和rrs基因(编码16S rRNA),并检测了strA基因是否存在。序列分析表明,5株被测抗性菌株的rpsL基因均发生了突变,其中4株在氨基酸43位、1株在88位,均由赖氨酸突变为精氨酸,而rrs基因未发生突变,strA基因未被检测到。表明实验室诱导获得的水稻白叶枯病菌抗性菌株对链霉素的抗药性是由rpsL基因突变引起的。抗性风险研究表明,抗性突变体的抗药性在无药剂压力下可稳定保持,其致病性、生长速率与敏感菌株相比无明显差异,竞争性低于或略低于敏感菌株,抗性自发突变率较高,且抗性突变为单一位点突变,病害循环为多循环,因此由rpsL基因突变引起的水稻白叶枯病菌对链霉素的抗性风险较高。     

稻螟赤眼蜂实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选适合稻螟赤眼蜂试验使用的内参基因,本试验根据转录组测序结果挑选了十个稻螟赤眼蜂候选内参基因（包括PABPC1L、ACTR2、ARPC2、EF1a、EEF1D、SFRS7、HSP70、CSNK1a1、GAPDH和TMEM209）,分别检测了其在包括温度、取食、农药刺激等不同条件下,以及在稻螟赤眼蜂不同的发育历期的表达情况。利用RefFinder分析软件对Delta CT、BestKeeper、NormFinder、GeNorm四种软件分析基因表达稳定性的结果进行综合排序。结果表明,不同温度、取食、农药刺激和不同发育历期处理,表达相对稳定的内参基因分别为EF1a、EEF1D;SFRS7、ARPC2;PABPC1L、TMEM209;PABPC1L、ARPC2。本研究结果为在不同条件下选择稻螟赤眼蜂内参基因提供了参考,也有利于在稻螟赤眼蜂的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。     

淀粉酶产色链霉菌1628中toyF基因的克隆与丰加霉素合成相关性

为考察编码腺苷琥珀酸裂解酶toyF基因对淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628合成丰加霉素的影响,本研究设计简并引物,首次克隆获得了菌株1628的toyF基因,并构建了敲除质粒pKC1132-toyF',通过接合转移转入菌株1628,获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果表明,与原始菌株1628相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低66.7%、87.5%。在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达toyF基因构建了重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7和8.3倍。由此可见,toyF基因是参与菌株1628生物合成丰加霉素的关键酶基因。本文toyF基因的克隆及其功能研究,为克隆完整的丰加霉素生物合成基因簇及其丰加霉素生物合成机制的研究奠定了基础。     

茶卡盐湖中耐盐抗真菌芽孢杆菌的分离和鉴定

本试验从茶卡盐湖水及淤泥中分离得到了51株细菌,通过16S rDNA及gyrB基因测序分析初步确定了菌株的分类地位,并测定了各菌株对苹果根腐病菌Fusarium spp.、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici等13株病原菌的抑菌谱及对NaCl的耐受性。共筛选获得13株对13种真菌病害均有抑菌作用的菌株,13株广谱生防菌株在NaCl浓度为10%的LB培养基上都能正常生长,其中菌株10和27在NaCl浓度为15%的LB培养基中的生长速度显著高于生防菌B916。盐湖环境为耐盐生防菌的筛选提供了丰富的资源,本研究获得的耐盐广谱生防菌对盐碱地真菌病害的防治提供了菌株资源。     

AdpAsd对于淀粉酶产色链霉菌1628的形态分化和丰加霉素合成的影响

为阐明AdpA与淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628形态分化和合成丰加霉素（Toyocamycin，TM）的相关性。本研究设计简并引物成功克隆了来源于淀粉酶产色链霉菌1628大小为1263 bp的adpA_sd基因（GenBank登录号：JX847412）。结果发现，AdpA_sd的氨基酸序列与灰色链霉菌Streptomyces griseus的AdpA_g及天然色链霉菌Streptomyces coelicolor的AdpA_c的同源性分别为80.7%和78.9%。将adpA_sd基因置于载体pIB139启动子PermE^*下游，构建了重组质粒pIB139-adpA_sd，将其通过接合转移法分别转入菌株1628-T15（高产TM）和1628-T62（低产TM，孢子合成受阻）中，获得重组菌1628-T15A和1628-T62A。结果表明，与出发菌株1628-T62相比，重组菌1628-T62A产孢能力得到一定程度的恢复；重组菌1628-T15A与出发菌株1628-T15相比，整体形态无明显变化。摇瓶发酵试验表明，重组菌1628-T62A较出发菌株1628-T62的TM合成能力显著提高，最终TM产量提高了近3倍，而重组菌1628-T15A的TM产量比出发菌株1628-T15仅有小幅提升。以上结果证实adpA_sd参与淀粉酶产色链霉菌1628形态分化以及TM合成，为今后深入理解adpA_sd的分子调节机制奠定了基础。     

Evaluation of six commonly used reference genes for gene expression studies in herbicide‐resistant Avena fatua biotypes

Avena fatua of the family Poaceae is one of the most common and economically damaging grass weeds. Resistance to herbicides that inhibit acetyl‐coenzyme A carboxylase and acetolactate synthase activities has recently been detected in A. fatua. The resistance may be due to mutations in the herbicide targets and/or enhanced herbicide metabolism resulting from changes in gene expression, including in genes involved in detoxifying herbicide active ingredients. To analyse gene expression, stable housekeeping genes must be experimentally determined and used for data normalisation. In this study, A. fatua plants were treated with different herbicide types and plant materials were harvested at three time points following treatment. Six candidate reference genes (18S rRNA, ACT, EF1α, GAPDH, TBP, and TUB) were selected, sequenced and analysed by RT‐qPCR. The resulting data were assessed using four algorithms from the RefFinder software to determine gene expression stability. We identified TBP and GAPDH as the most stably expressed A. fatua reference genes following herbicide treatment.     

对甜菜夜蛾高杀虫毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ah5的克隆表达

利用生物活性测定方法从本实验室已分离保存的Bt菌株中筛选出了5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的菌株。该5株Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC₅₀值为0.556~0.914mg/mL胞晶混合物,其中GS3菌株杀虫活性最高,LC₅₀值为0.556mg/mL胞晶混合物;包含晶体形态主要是球形、大菱形、小菱形等;所含基因类型主要是cry1Aa、cry1Ab、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ad、cry2Ah、cry7Ab、cry9Ba等;5株菌株均表达约60kD和130~150kD蛋白,其中2株还表达较弱的80kD蛋白。从GS3菌株中克隆得到一种新的cry2A基因,GenBank登录号为KT692984,由Bt基因国际命名委员会命名为cry2Ah5。该基因开放阅读框为1899bp,编码632个氨基酸,编码蛋白分子量为70.8kD,等电点pI为8.18,与其他Cry2Ah蛋白序列相似性为97%~99%。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达约70kD蛋白,与预测分子量相符。本研究筛选得到5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的Bt菌株,克隆表达了一种新的cry2A基因cry2Ah5,为甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株及基因资源。     

亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白的交互抗性分析

Cry9Ee是近年来发现的对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)等害虫具有高毒力的蛋白,具有良好的应用前景。为了明确亚洲玉米螟对Cry9Ee和Cry1Ab蛋白是否存在交互抗性,本文首先分别表达、活化、纯化了Cry9Ee和Cry1Ab蛋白,进而对敏感和Cry1Ab抗性亚洲玉米螟进行生物活性测定;随后对2种蛋白在敏感亚洲玉米螟中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,简称BBMVs)上的结合进行分析比较。生物活性测定结果表明,Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的活性片段对敏感亚洲玉米螟的LC₅₀分别为3.04和0.89 μg/g;而Cry9Ee活性片段在5.00 μg/g的浓度下,对Cry1Ab蛋白抗性亚洲玉米螟致死率高达96%,与对敏感种群活性相当。竞争结合试验表明,Cry9Ee和Cry1Ab两种蛋白间不存在竞争结合,推测它们在亚洲玉米螟中肠上存在不同的受体。综合生物活性测定及体外结合试验两方面结果得出结论：亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白不存在交互抗性。cry9Ee基因可以作为理想的候选基因,用于我国新一代转基因抗虫玉米的研制,为延缓和克服亚洲玉米螟对转基因抗虫玉米抗性的产生提供重要保证。     

稻瘟病抗性基因分析研究

 本文报道了应用累积曲线分布法[1-3],在温室用我国多个菌系人工接种鉴定了丽江新团黑谷×会泽老来黄、丽江新团黑谷×抬头白谷两个组合11套F₃系统.结果表明:会泽老来黄对A₁、D₁、G₁3个菌系的抗性是由一对显性基因控制的;对C₁₃、F₁两菌系的抗性是由两对显性基因控制的,其中一个控制高抗反应,另一个呈中抗反应.抬头白谷对C₁₃、G₁小种的抗性是由一对显性基因控制的;对A₁、E₁、F₁三个菌系的抗性是由两对显性基因控制的;对D₁菌系的抗性是由两对互补显性基因控制的.     

昆虫病原真菌对梨网蝽防治潜力的室内评测

梨网蝽Stephanitis nashi是多种果树和园林植物上的重要害虫,在长江流域、华北地区为害严重。梨网蝽发生世代多,易产生抗药性,筛选出能替代化学农药的生物控制因子,是对梨网蝽实现有效可持续控制的重要手段。本文通过菌株筛选平台,挑选出产孢较好的15株昆虫病原真菌,用喷雾法测定其对梨网蝽成虫和若虫致病力的差异。在1.0×10⁶孢子/mL孢子悬浮液接种后,菌株Bb2359等6株球孢白僵菌和1株金龟子绿僵菌Ma67对梨网蝽成、若虫累积死亡率均达到100%,其中菌株Bb2352、Bb2359、Bb2372等对成虫的LT₅₀小于4 d,而菌株Bb2352、Bb2359、Ma67对2龄若虫的LT₅₀均在5 d以内,LT₅₀显示菌株对成虫的致死速度要快于对若虫的致死速度。在时间-剂量-死亡模型研究中,梨网蝽成、若虫在接种后的第3 d到第7 d,累积死亡率均呈直线快速上升趋势,而在前后均变化平缓。同时,各菌株均表现出明显的死亡率随接种浓度增高而不断增高的剂量效应。菌株Bb2359对梨网蝽成虫、若虫均显示出很高的毒力水平,致死中浓度LC₅₀分别为6.466×10⁴和4.747×10⁴孢子/mL;在1.0×10⁷孢子/mL浓度下致死中时LT₅₀分别为2.89和3.54 d。该菌株具备高效快速的杀虫特点,具有开发为真菌生物农药的巨大潜力。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白研究进展

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),属于蜡样芽胞杆菌族,芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌,与其它芽胞杆菌的区别是在形成芽胞的同时,伴随有杀虫晶体蛋白(Cry蛋白)的产生。Cry蛋白对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和双翅目等多种害虫具有特异的杀虫作用,因此,Cry蛋白以微生物杀虫剂或转Bt基因植物的形式而被广泛应用于害虫生物防治中。本文从Bt菌株的发掘、cry基因的转录调控机制、Cry蛋白的结构功能及作用机制等方面进行综述,为Bt杀虫蛋白的推广应用、Bt蛋白的定向改造和构建高效广谱的工程菌提供参考。