武夷菌素产生菌阻断突变株的筛选及分析

以不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis为出发菌株,分别用亚硝基胍、氯化锂、微波为单一诱变剂,亚硝基胍和氯化锂为复合诱变剂进行处理,从亚硝基胍处理的菌株中筛选到1株丧失抑菌活性且性状稳定的突变株N1。突变株孢子丝为长螺旋形,孢子呈椭圆形,与出发菌株相比,在形态上没有显著变化且产孢量无变化。突变株的抑菌活性发生了显著变化,对所有8种供试菌株均无抑制作用。HPLC结果显示与出发菌株不同,突变株中抗生素的特征峰消失。本研究为今后开展武夷菌素合成途径和生物合成基因研究奠定基础。     

链霉菌S10遗传操作系统的优化

链霉菌StreptomycespratensisS10是分离自番茄叶霉病异常菌落上的一株生防菌,具有良好的生防应用价值。建立高效稳定的遗传操作系统对该生防菌进行基因定向改造、提高基因表达水平及深入研究其生防分子机制具有重要意义。本试验以具有安普霉素抗性基因标记的温敏型质粒pKC1139为载体,大肠杆菌Escherichia coli ET12567(pUZ8002)为供体菌,链霉菌S10为受体菌,通过接合转移的方法对其遗传操作系统进行优化。结果表明,选择高氏一号培养基为链霉菌S10接合转移的最适培养基,孢子50℃热激10 min,最适供受体比为1:100,安普霉素添加的最适浓度为25μg/mL,接合转移16 h后覆盖抗生素,添加MgCl2终浓度为15 mmol/L时接合转移效率最高,达到8.3×10-7。利用该遗传转化系统成功得到了一个调控基因的双交换突变株。获得链霉菌S10稳定高效的遗传操作系统,为进一步构建高产菌株和研究抑菌活性物质合成机理奠定了基础。     

武夷菌素高产基因工程菌发酵培养基的优化

为进一步提高武夷菌素的产量,以基因工程菌Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis W273为试验菌株,采用单因子试验确定发酵培养基的最适6种营养成分为玉米粉、葡萄糖、黄豆面、氯化铵、碳酸钙和氯化镁;应用SAS软件中的Plackett-Burman设计法,对影响菌株发酵生产武夷菌素的6个因素进行了筛选,确定葡萄糖和碳酸钙为影响摇瓶发酵生产武夷菌素的主要因素。利用响应面分析法对2个主要因素的最佳水平及其交互作用进行研究,建立了二次回归方程,Y=218.18+270.28X₁+1274.74X₂-3.28X₁²-5.4X₁X₂-200.98X₂²,并最终确定最佳培养基配方为玉米粉20 g/L、葡萄糖39 g/L、黄豆面20 g/L、氯化铵4 g/L、碳酸钙2.65 g/L、氯化镁0.4 g/L。以新配方在28℃、220 r/min进行摇瓶发酵60 h后,武夷菌素效价平均值为7215 μg/mL,较原始培养基发酵后武夷菌素效价提高了26.5%。     

武夷菌素对番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)的作用方式

 借助光镜和透射电镜观察了武夷菌素对番茄灰霉菌菌丝生长和分生孢子萌发的形态影响,结果表明,武夷菌素处理的菌丝异常生长,分生孢子萌发的芽管膨大缢缩,菌丝体内液泡增多;武夷菌素能引起菌丝细胞膜透性的变化,造成液体培养基电导率增加;同位素标记的¹⁴C-谷氨酸、³H-葡糖胺和³H-腺嘌呤掺入实验表明,武夷菌素能抑制菌丝蛋白质的合成,对细胞壁几丁质和核酸的合成没有影响。     

武夷菌素对番茄灰霉菌的抑制作用及对番茄抗病性相关酶活性的影响

采用凹陷载玻片法测定了武夷菌素对番茄灰霉菌分生孢子萌发的抑制作用,在离体番茄叶片上测定了被武夷菌素处理后的番茄灰霉菌菌丝和分生孢子致病性的变化以及武夷菌素对番茄幼苗体内抗病性相关酶活性的影响。结果表明:武夷菌素对番茄灰霉菌的分生孢子有较强的抑制作用,其EC₅₀为14.1μg／mL。浓度为100μg／mL的武夷菌素可完全抑制孢子的萌发。武夷菌素能使灰霉菌菌丝和分生孢子的致病性明显下降,同时还能诱导番茄体内抗病性相关酶(SOD、POD、PPO、PAL)活性的增强,提高番茄幼苗的抗病性。     

武夷菌素产生菌CK-15中转录调控因子wysR3的功能研究

wys R3是武夷菌素产生菌Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15中可能的调控因子。为了验证wys R3是否参与武夷菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于过表达wys R3的基因重组质粒p SETC-R,并通过接合转移的方法转化至武夷菌素产生菌S.wuyiensis CK-15中,构建过表达菌株。过表达菌株生长速度明显缓慢;通过摇瓶发酵和HPLC检测分析发现,武夷菌素产量与野生型菌株相比没有发生明显变化;DNS法测定发酵液中糖含量也没有发生明显变化,说明该基因与武夷菌素的产量和糖含量在该种条件下没有直接关系,但是影响菌株表型生长。     

福建青枯雷尔氏菌的遗传多样性及其生防放线菌的筛选

为了明确福建青枯雷尔氏菌（简称青枯菌）的遗传多样性,综合菌株的演化型、生化型及基于内源葡聚糖酶基因egl的序列变种鉴定,对福建省8个地区的番茄、辣椒和茄子寄主分离的56株青枯菌进行分析。结果表明：供试的56株青枯菌均属于演化型Ⅰ;53株为生化型Ⅲ（占94.64%）,1株为生化型Ⅱ,2株为非标准生化型;从序列变种来看,4株来自茄子的青枯菌均属序列变种15,24株来自辣椒的青枯菌中,23株属于序列变种14,1株为序列变种16,28株番茄青枯菌鉴定出7个序列变种。进一步,选择上述鉴定的生化型Ⅲ和生化型Ⅱ的代表菌株为靶标菌进行生防菌筛选。结果表明,供试14株放线菌中,筛选到1株对生化Ⅲ青枯菌有拮抗作用的放线菌FJAT-31535。基于菌落形态特征和16S rRNA基因序列相似性分析,菌株FJAT-31535属于链霉菌属（Streptomyces sp.）。     

嘧肽霉素高产菌株的选育

以不吸水链霉菌辽宁变种为出发菌株,经紫外线、亚硝酸诱变和紫外线与嘧肽霉素复合诱变,选育出了嘧肽霉素的高产菌株,抑菌圈直径由原来的20.5mm提高到36.4mm。传代培养5代表明,该高产菌株遗传特性稳定。     

黄淮麦区小麦全蚀病菌群体的遗传多样性分析

为了解小麦全蚀病病菌的群体组成和遗传多样性,采用8对多态性较好的微卫星标记,对我国黄淮麦区的116个小麦全蚀病菌株进行了分析。8个SSR标记的平均等位基因数为4.25个,多态性信息含量的平均值为0.66。供试菌株的平均有效等位基因数和基因遗传多样性指数分别为1.46和0.27,漯河群体的遗传多样性水平最高,周口群体最低。不同群体间遗传距离均较小,为0.0199~0.1153,其中徐州和周口群体间的遗传距离相对较大,而周口和驻马店群体间的遗传距离相对较小。分子方差分析结果显示,小麦全蚀病菌群体间和群体内均存在着一定的遗传分化,群体间的遗传变异占总变异的10%,群体内遗传变异占90%。6个群体间的基因流为3.5。根据SSR多态性,对来源不同菌株的UPGMA聚类分析结果显示,小麦全蚀病菌群体结构与地理来源有一定的关系。