Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CD163受体功能域鉴定

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染易感细胞受体。研究表明CD163受体的前2个SRCR区域与PRRSV感染无关。为确定PRRSV感染细胞过程中CD163受体关键SRCR区域,构建表达野生型CD163受体和缺失不同个数SRCR区域的CD163受体突变体质粒。将质粒转染BHK-21细胞24 h后,XH-GD株PRRSV感染细胞,进行间接免疫荧光(IFA)观察。结果显示,CD163前4个SRCR重复区缺失不影响PRRSV感染,SRCR5是PRRSV感染细胞所必须。为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用及与其他受体之间相互关系提供试验基础。     

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒血清在Marc-145细胞上对病毒复制影响

制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,探索其对病毒复制影响,通过大量培养猪繁殖与呼吸综合征病毒XH-GD株病毒,高速离心后蔗糖梯度纯化浓缩并免疫新西兰大白兔,4免后采集抗血清,ELISA法测定效价。同时将抗血清与病毒共同孵育接种Marc-145细胞,荧光定量PCR和TCID50测定病毒复制情况。成功制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,效价达1640,抗血清可以在m RNA水平和TCID50上降低病毒滴度。结果表明,兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清可以在Marc-145细胞上抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制。     

利用荧光定量PCR方法研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞的增殖规律

摘要:猪繁殖与呼吸综合征病毒可以在原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)、CL2621细胞系及Marc-145细胞系上生长繁殖,但对于其增殖规律不甚了解。试验利用实时荧光定量PCR技术,研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖规律;结果发现:病毒在接种后12 h开始大量增殖,在18-36 h增殖最为迅速,在36-48 h病毒增殖达到最高峰;研究还发现在18 h 时Marc-145细胞开始释放病毒,48 h达最高峰。该结果为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理及利用细胞毒生产疫苗提供试验基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的长链非编码RNA和mRNA转录组分析

为了挖掘猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染Marc-145细胞后宿主细胞长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA表达谱的变化,对PRRSV感染Marc-145细胞的lncRNA和mRNA进行转录组测序和分析。生物信息学分析结果显示,PRRSV感染后Marc-145细胞有39个差异表达lncRNA(DElncRNA)和1 320个差异表达mRNA(DEG)。进一步的富集分析结果显示,这些DElncRNA和DEG主要富集在氧化磷酸化信号通路。DElncRNA和DEG的联合分析结果显示,与lncRNA共表达的mRNA主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、神经营养素信号通路、AMPK信号通路、HIF-1信号通路、内质网中的蛋白质加工和碳代谢相关的信号通路,这些通路主要与宿主免疫有关。综上,PRRSV感染导致Marc-145细胞的lncRNA和mRNA表达谱均发生了改变,经生物信息学分析,推测差异表达产物可能在宿主对PRRSV感染的先天免疫反应中发挥重要作用。     

Marc-145细胞传代培养条件优化

采用单因素法研究在细胞传代培养过程中复苏温度、血清浓度、生长液pH值、培养温度、消化液浓度、传代比例等因素对Marc-145细胞传代培养的影响。结果表明：复苏温度37℃、血清浓度10％、生长液pH值7．2、培养温度37℃、消化液浓度0．25％、传代比例1：3时Marc-145细胞传代培养效果最佳。     

猪CD150真核表达载体的构建及其在Marc-145细胞中的稳定表达

试验克隆获得了猪全长CD150基因序列,将其连接到真核表达载体pEGFP-N1上获得重组载体pEGFP-N1-CD150.通过测序、Western-blot、瞬时转染,确认了pEGFP-N1-CD150的表达效果.结果表明,pEGFP-N1-CD150载体测序结果与CD150基因序列比对率100％;Marc-145细胞...     

Marc-145细胞微载体模化培养PRRSV

为确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件。将PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上增殖,以半数细胞感染剂量为检测指标,对病毒维持液中血清浓度、接毒时间、感染复数(MOI)和收毒时间进行优化。结果表明,细胞培养后72 h接种病毒,病毒维持液中血清含量为2%,病毒感染复数为0.05,病毒感染48 h后PRRSV效价较高达到10~(6.6)TCID_(50)·mL~(-1),确定了PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上的增殖条件。     

猪波形蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用

为了研究波形蛋白在介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞过程中的作用,利用RT-PCR方法从PRRSV非易感细胞系猪肾细胞系PK-15细胞中扩增目的基因,克隆入pET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达的重组猪波形蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用病毒抑制试验检测重组猪波形蛋白及多克隆抗体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用。结果表明,成功扩增猪波形蛋白基因并克隆入pET-28a载体,经诱导后得到高效表达,纯化后免疫兔子产生高价血清抗体(105)。病毒阻断结果表明,猪波形蛋白及多克隆抗体均能阻断PRRSV感染Marc-145细胞。这为以波形蛋白为基础的PRRSV受体阻断抑制剂的研究提供了实验依据。     

感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库的构建

【目的】用强、弱PRRSV GD株传代毒株感染Marc-145细胞,构建Marc-145细胞的差异基因cDNA文库。【方法】以感染PRRSV GD株第100代弱毒株的Marc-145 cDNA为测试组（Tester）,以感染PRRSV GD株第5代强毒株的Marc-145 cDNA为对照组(Driver),采用抑制性消减杂交方法,构建强、弱PRRSV GD株感染的Marc-145细胞差异基因cDNA文库,并使用LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）技术对试验结果进行验证。【结果】经4次抑制性消减杂交重复试验,得到S8、S29、L6、L26及L30等5个稳定差异表达的基因。LAMP结果显示,S8、S29、L6、L26及L30均为差异表达基因,这与抑制性消减杂交结果吻合。【结论】成功构建了感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库,为研究S8、S29、L6、L26和L30基因与PRRSV感染体外培养细胞Marc-145的关系奠定了基础。     

感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库的构建

【目的】用强、弱PRRSV GD株传代毒株感染Marc-145细胞,构建Marc-145细胞的差异基因cDNA文库。【方法】以感染PRRSV GD株第100代弱毒株的Marc-145 cDNA为测试组(Tester),以感染PRRSV GD株第5代强毒株的Marc-145 cDNA为对照组(Driver),采用抑制性消减杂交方法,构建强、弱PRRSV GD株感染的Marc-145细胞差异基因cDNA文库,并使用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)技术对试验结果进行验证。【结果】经4次抑制性消减杂交重复试验,得到S8、S29、L6、L26及L30等5个稳定差异表达的基因。LAMP结果显示,S8、S29、L6、L26及L30均为差异表达基因,这与抑制性消减杂交结果吻合。【结论】成功构建了感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库,为研究S8、S29、L6、L26和L30基因与PRRSV感染体外培养细胞Marc-145的关系奠定了基础。     

激发子隐地蛋白(cryptogein)基因的克隆及其植物表达载体的构建

从隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)中克隆cryptogein蛋白激发子基因,经测序证实后.针对病原菌侵染和cryptogein基因本身的特点,选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型、并受病原菌诱导的水稻苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的启动子;同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外,更好地与植物细胞膜受体互作,在cryptogein基因前还融合了烟草病程相关蛋白PR1b的信号肽.然后将此融合基因克隆到植物表达载体CHF3中,获得植物双元表达载体CHF3-PAL-PR1b-Cry,再将此载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105中.     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。     

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素18转录时相的影响

为了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起细胞炎性反应特别是白细胞介素18(IL-18)的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-18的分泌水平.结果表明,IL-18的表达量在1h无明显变化、在3,24h增加...