坏死梭杆菌白细胞毒素研究进展

坏死梭杆菌是动物和人的各种坏死化脓感染的条件性致病菌.坏死梭杆菌的白细胞毒素是一种高度不稳定性分泌蛋白,被认为是主要的毒力因子.坏死梭杆菌白细胞毒素基因的开放阅读框(lktAORF)包括9 726 bp,编码3 241个氨基酸,总分子质量为336 ku的蛋白,且与其他细菌的细胞毒素没有任何相似的序列.覆盖在整个坏死梭杆菌lktA ORF上的5个短的重叠的多肽分别是BSBSE,SX,GAS,SH和FINAL,将它们在大肠埃希菌中表达,所有的多肽都有免疫原性,但GAS引起最小的抗体反应,BSBSE和SH对坏死梭杆菌攻击诱导产生了很强的保护力,比坏死梭杆菌的培养上清内全长活性lkt或无活性上清的保护性要好得多.     

影响坏死梭杆菌分泌白细胞毒素因素的研究

利用已分离坏死梭杆菌菌株,建立坏死梭杆菌白细胞毒素活性体外检测方法,并评价培养条件对坏死梭杆菌天然白细胞毒素活性的影响。结果表明,预还原、厌氧无菌心脑浸液肉汤培养基(pH7.3左右)、培养时间10h～12h(对数生长期后期),此工艺参数下获取的细菌培养物上清液的白细胞毒性最大。获得的坏死梭杆菌天然白细胞毒素经Western blot证实,能被抗白细胞毒素重组BSBSE蛋白的兔血清识别,表明提取的白细胞毒素具有反应原性。     

坏死梭杆菌检测方法研究进展

坏死梭杆菌是一种严格厌氧的革兰阴性(G-)杆菌,可以依据坏死梭杆菌的菌体形态、菌落特征、生化试验、耐药性试验、酶特性试验等进行检测。根据坏死梭杆菌的16 S rRNA基因序列、16 S～23 SrRNA基因间序列以及rpoB基因序列,可以对其进行菌种水平上的鉴定;根据坏死梭杆菌的gyrB基因序列和白细胞毒素操纵子启动子区序列,可以对坏死梭杆菌进行亚种水平的鉴别。环介导的等温扩增(LAMP)技术的发展也为坏死杆菌病的快速诊断提供了检测方法。     

坏死梭杆菌研究进展

坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)是一种严格厌氧的革兰阴性多形态杆菌,其致病因子包括内毒素、白细胞毒素、血小板凝集因子、血凝素和溶血素等,其中主要的致病因子是白细胞毒素。由坏死梭杆菌引起的疾病在不同国家和地区均有发生,鹿、羊等反刍动物感染坏死梭杆菌时表现为跛行,关节肿大,肝脓肿和腐蹄病,猪、马等动物感染坏死梭杆菌时主要表现为跛行,严重时继发其他细菌感染,对养殖业造成巨大损失;人类感染该细菌时表现为急性咽炎综合征(Lemierres syndrome)。论文通过对国内外坏死梭杆菌及其疫苗研究和新型佐剂的开发进行综述,以期为该细菌疫苗的研制提供参考。     

牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因的原核表达及其免疫活性分析

参考羊腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的抗原表位基因序列,利用DNAStar软件预测了牛腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的5个抗原表位区,设计5对在上游和下游含有特异性限制性内切酶的引物,以牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因阳性质粒pMD18-T-lkrA为模板,PCR扩增了预测的5个抗原表位区基因,分别命名为PL1、PL2、PL3、PL4和PL5,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX HTa后转化E.coli BL21(DE3),37℃条件下,用IPTG诱导表达,结果PL1、PL2、PL4和PL5在pGEX-6p-1中获得了表达,而PL3在pPROEX HTa中获得了表达。Westem blot试验结果表明,牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素蛋白5个抗原表位区的重组蛋白PL1、PL2、PL3、PL4和PL5均与坏死梭杆菌多克隆血清反应。     

坏死梭杆菌病免疫学研究进展

长期以来,国内外研究人员一直致力于坏死梭杆菌的免疫性及免疫作用研究,但进展缓慢,主要原因是坏死梭杆菌免疫作用弱,无法产生保护性免疫。直到20世纪80年代末,对坏死梭杆菌免疫研究才有了新的突破,初步研制出坏死梭杆菌疫苗,并经小群动物试验获得成功。文章就坏死梭杆菌免疫性及免疫作用的初始研究、坏死梭杆菌免疫原筛选研究、抗原间的相互作用、疫苗研究进展进行了综述,并展望了坏死梭杆菌疫苗研究的发展趋势。     

坏死梭杆菌白细胞毒素基因的BSBSE片段的原核表达及抗血清制备

本研究以国内分离的牛源坏死梭杆菌F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增BSBSE片段,克隆到pMD18-T载体上,鉴定并测序正确后,构建pET32a-BSBSE表达质粒,转化E．coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS—PAGE检测重组蛋白表达、Western blot检测重组蛋白反应原性。以该重组蛋白免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测抗血清效价。结果表明,PCR扩增得到1100bp的BSBSE片段,以此片段构建了pET32a—BSBSE表达质粒,经诱导后获得了目的蛋白表达,以Western blot检测该重组蛋白证明为本研究的目的蛋白,并且与抗体具有反应原性。以间接ELISA检测该重组蛋白免疫兔制备的抗血清效价达10^5。研究结果将为坏死梭杆菌毒力因子（1kt）的深入研究奠定了物质基础。     

致病性鹿源坏死梭杆菌分离鉴定

应用厌氧培养技术,从患坏死杆菌病鹿的病变坏死组织和脓汁中仞出一种主要的病原菌,通过细菌形态学、染色反应、培养特性、生化试验、血清学反应等鉴定方法,确定该病原分离株为严格厌氧性坏死棱杆菌,分型鉴定为Ａ、ＡＢ和Ｂ型;实验动物感染证明Ａ和ＡＢ型坏死梭杆菌为致病性菌株。     

奶牛腐蹄病坏死杆菌分离鉴定及白细胞毒素基因lktA1序列分析

为分离纯化奶牛腐蹄病坏死杆菌,分析其与其他菌株的亲缘关系,本研究利用坏死杆菌白细胞毒素特异性引物,对奶牛腐蹄病病牛蹄部拭子样品进行了PCR检测,利用厌氧培养基对PCR检测阳性样品进行了坏死杆菌的分离培养,以分离的坏死杆菌基因组DNA为模板,对白细胞毒素基因进行了克隆和序列分析。结果显示,9份奶牛腐蹄病病牛蹄部拭子样品PCR检测结果均为阳性,对其中一份样品中的坏死杆菌进行分离培养,获得了纯培养物,命名为bFR13-1。坏死杆菌bFR13-1菌株白细胞毒素基因测序结果显示,与GenBank已发表的H05、A25和B35菌株的白细胞毒素基因在核苷酸水平的同源性分别为98.40%、98.35%和90.79%,推导氨基酸的同源性分别为97.7%、97.6%和89.0%。进化树分析结果显示,坏死杆菌bFR13-1菌株白细胞毒素与H05菌株的同源性最高,bFR13-1菌株与H05菌株和A25菌株呈较近亲缘关系。结果表明,不同坏死杆菌分离株的白细胞毒素呈现一定的变异性,这种变化是否与坏死杆菌致病性相关,值得深入研究。     

坏死梭杆菌外膜蛋白提取及免疫原性分析

从坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,FN)中提取外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)并分析免疫原性。采用无菌心脑浸液(BHI)肉汤培养基培养坏死梭杆菌,用20mmol/L HEPEs-LiCl缓冲液提取外膜蛋白,经SDS-PAGE、Western blot和接种小鼠病理学检测分析表明,具有唯一条带,分子质量为44.5ku,具有良好的免疫活性并有一定毒性,研究结果为坏死梭杆菌亚单位疫苗研制奠定了基础。     

Isolation,Identification and Sequence Analysis of Leukotoxin Gene lktA1 of Fusobacterium necrophorum of Cow Footrot

For separation and purification of Fusobacterium necrophorum of cow footrot, and analysis of genetic relationship with other strains, the hoof ministry swab samples were detected by PCR based on specific primers of leukotoxin gene, and genomic DNA were isolated from PCR positive samples of Fusobacterium necrophorum culturing in anaerobic medium.The genes of leukotoxin were cloned and sequenced.The results showed that nine of hoof ministry swab samples were all PCR positive samples, and we obtained Fusobacterium necrophorum pure culture from one of the samples which named bFR13-1.The gene sequencing results indicated that the homologies of leukotoxin gene nucleotide sequence of bFR13-1 strain compared with H05, A25 and B35 strains from GenBank were 98.40%, 98.35% and 90.79%, respectively, and the homologies of deduced amino acid sequence were 97.7%, 97.6% and 89.0%, respectively.Phylogenetic tree analysis results showed that leukotoxin gene of Fusobacterium necrophorum bFR13-1 and H05 had high homology and bFR13-1, H05 and A25 showed a close genetic relationship.The result indicated that leukotoxin showed variability between different Fusobacterium necrophorum isolated strains, and it was worth to study whether this change and pathogenicity of Fusobacterium necrophorum were related.     

坏死杆菌白细胞毒素作为腐蹄病亚单位疫苗候选抗原的研究前景

腐蹄病（foot rot）是侵害反刍动物趾间皮肤及深层软组织为主的,严重影响奶牛生产性能和产奶质量的一种常见疾病。由于传统的灭活菌苗具有免疫效果差、副反应严重及大量生产困难等缺点,使腐蹄病基因工程疫苗的研究成为热点。笔者对坏死杆菌白细胞毒素作为腐蹄病亚单位疫苗候选抗原研究的最新进展进行综述,希望为腐蹄病亚单位疫苗的研究提供参考。     

坏死梭杆菌致家兔肝脓肿模型的建立

采用梅花鹿源坏死梭杆菌HNFnf分离株以不同浓度菌量于家兔耳缘静脉注射,尝试建立家兔感染坏死梭杆菌肝脓肿模型。通过观察家兔临床症状、剖检病变和病理组织学观察,建立了坏死梭杆菌分离株家兔感染模型。攻毒家兔7 d内全部死亡,死亡前家兔表现为采食减少、喜卧、后肢无力、消瘦等。尸体进行病理剖检可见明显病理变化,肺脏表面大量出血,且伴有结节样病变;肝脏质地较软,出现均匀的灰黄脓肿;脾脏严重肿大,呈暗紫色;肾脏多处出血斑;严重的肠道胀气,膀胱积尿。病理组织学观察可见肾脏近曲小管与远曲小管之间有少量的粉红色纤维素渗出;肝脏中形成明显的染色深蓝的脓肿结构,其周围有大量细胞核深染的炎性细胞浸润,肝脏肝小叶固有结构消失,肝细胞脂肪变性;肺泡和支气管内有大量红染的纤维素渗出。采取耳缘静脉攻毒方式,该细菌对家兔的最低致死量为1.2×10¹⁴ CFU。     

牛源坏死梭杆菌43K外膜蛋白的黏附特性研究

旨在明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附特性。将43K OMP基因克隆连接至pET-32a载体,转化入大肠杆菌BL21 DE3中,通过IPTG诱导进行原核表达,应用黏附试验、天然蛋白竞争试验、抗体抑制试验和蛋白酶水解试验,明确牛源坏死梭杆菌43K OMP的黏附性,同时将纯化的重组蛋白和提取的天然43K OMP与牛子宫内膜细胞和牛乳腺上皮细胞共孵育,观察43K OMP对细胞的黏附作用。结果显示：43K OMP基因克隆到pET-32a载体中,随后在大肠杆菌BL21 DE3以包涵体形式成功表达;携带重组质粒(H2019)的大肠杆菌经IPTG诱导后,与空载体对照相比,与宿主细胞的结合显著增强(P<0.05);天然43K OMP与细胞共孵育后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05);H2019与43K OMP多抗或单抗预孵育后,显著降低黏附宿主细胞的细菌数量(P<0.05);经不同浓度蛋白酶K处理H2019后,黏附细胞的细菌数量显著降低(P<0.05),且与蛋白酶K浓度呈现剂量依赖关系。同时,43K OMP天然蛋白和重组蛋白能黏附于牛子宫内膜细胞和乳腺上皮细胞表面。...     

Fusobacterium necrophorum septic arthritis of the temporomandibular joint in an Australian Stockhorse mare

Septic osteomyelitis of the temporomandibular joint (TMJ) is rarely seen in equine medicine with few reported cases, and none reported involving Fusobacterium necrophorum. This report describes the diagnosis and successful treatment of septic osteomyelitis of the temporomandibular joint (TMJ) in an 11-year-old Australian Stockhorse mare in Queensland, Australia.     

牛坏死杆菌的43 ku外膜蛋白在其黏附细胞中的作用初步分析

旨在明确牛坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)的43 ku外膜蛋白(43K OMP)在其黏附细胞中的作用,本研究将重组43K OMP蛋白和天然43K OMP蛋白与鼠乳腺上皮细胞共孵育,通过免疫荧光方法观察牛坏死杆菌43K OMP对鼠乳腺上皮细胞的黏附作用;同时利用天然蛋白竞争试验和抗体抑制试验明确43K OMP是否介导牛坏死杆菌与细胞的黏附,进一步利用牛坏死杆菌43K OMP基因缺失菌,评价43K OMP基因缺失对牛坏死杆菌黏附力的影响,阐明43K OMP在牛坏死杆菌黏附细胞中的作用。免疫荧光试验结果显示：天然43K OMP和重组43K OMP均能黏附于鼠乳腺上皮细胞表面,天然43K OMP与鼠乳腺上皮细胞或鼠肝细胞预孵育后,牛坏死杆菌黏附数量明显下降(P＜0.05);牛坏死杆菌与43K OMP多抗或单抗预孵育后,黏附于鼠乳腺上皮细胞或鼠肝细胞的牛坏死杆菌数量显著降低(P＜0.05);与牛坏死杆菌A25菌株相比,基因缺失菌A25Δ43K OMP黏附宿主细胞能力极显著下降(P＜0.01),黏附率分别降低了94.4%和90.4%。因此,43K OMP在牛坏死杆菌黏附细胞中发挥关键性作用,深入研究其黏附机理将为揭示牛坏死杆菌致病机制提供理论基础。     

坏死梭杆菌外膜蛋白基因的克隆与表达

依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93 ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。