O型、A型及Asia1型3个型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测方法的建立

为了建立针对流行于我国及周边国家主要口蹄疫病毒(FMDV)血清型的检测方法,本实验设计2对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时扩增O型、A型及Asia1型FMDV VP1全基因的套式RT-PCR (RT-nPCR)方法.该方法能特异性检测O型、A型和Asia1型FMDV,对其它相关动物病毒的检测结果均为阴性;比FMDV多重RT-PCR商品试剂盒敏感约1 000倍.利用该方法对10份FMDV样品进行扩增检测,结合扩增产物的克隆测序技术,对所检样品进行了准确定型.实验结果表明,该方法通用型强,可用于3个血清型FMDV的检测和分子流行病学调查.     

塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感、特异的能够鉴别诊断口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVV)二重实时荧光RT-PCR方法,根据FMDV及SVV的保守基因序列,设计了2套特异性引物和不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对二重实时荧光RT-PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对98份疑似FMDV和SVV感染的临床样品进行了检测。结果显示,成功建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,模板在10~1～10~7拷贝/μL有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV和pGEM-T/SVV重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线,方法特异性较好;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自98份疑似FMDV和SVV感染样品中检出9份FMDV阳性,10份SVV阳性,2份FMDV和SVV双阳性,并且和克隆测序结果一致。本研究建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,可用于FMDV和SVV的快速鉴别检测,为FMDV和SVV的鉴别诊断提供特异、敏感和高通量的方法。     

口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1～10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。     

塞内卡谷病毒和口蹄疫病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立塞内卡谷病毒(SVV)和口蹄疫病毒(FMDV)的快速鉴别检测方法,本试验根据SVV 3D基因序列和FMDV 3D基因序列,分别设计探针和引物,建立了可同时检测SVV和FMDV的双重荧光RT-PCR法。结果表明,该方法特异性强,能准确检测出SVV核酸和FMDV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)等病原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测到SVV和FMDV核酸质量浓度分别为1.35×10~(-5),1.68×10~(-5) mg/L。重复性好,Ct值变异系数小于4%。利用所建立方法对116份已知的临床样品进行检测,结果与参比方法一致。本试验建立的方法可用于SVV和FMDV的鉴别检测,为塞内卡病毒病和口蹄疫的诊断提供依据。     

口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

本研究依据已发表的FMDV保守基因区域RNA设计特异性引物,扩增目的RNA的6个区域,通过体系优化试验、敏感性试验和特异性试验建立了通用型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法。试验结果为:体系优化试验确定最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为60 min,最佳内、外引物比为1:12;应用本方法只能扩增出口蹄疫病毒,不能扩增出其他相关疫病病原;经测定试验所用FMDV核酸初始浓度为20.082μg/L,本方法可检出的最低浓度为在此基础上稀释2~(-3)×10~(-6)倍;应用所建立的方法检测相关疫苗样品,只有4种亚型口蹄疫疫苗有扩增曲线,其他样品均未扩增出任何曲线。     

同时检测口蹄疫病毒和牛肠道病毒双重RT-PCR方法的建立

为建立同时检测口蹄疫病毒(FMDV)和牛肠道病毒(BEV)的双重RT-PCR方法,本研究根据已发表的FMDV和BEV基因的5’UTR保守区域,分别设计、筛选出一对特异性引物建立了双重RT-PCR方法,并优化了反应体系和条件。采用该方法检测其他几种牛相关病毒结果均为阴性,表明特异性良好。该方法对FMDV的最低检出限为8 TCID50/0.1 mL,对BEV的最低检出限为2 TCID50/0.1 mL,表明其具有良好的敏感性。采用该方法检测了852份临床样品,并与病毒分离方法比较,结果两种方法检测结果完全一致。本研究首次建立了同时检测FMDV和BEV的双重RT-PCR快速检测方法,该方法的建立为FMDV和BEV的检测提供了一种技术手段。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

口蹄疫病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速、特异的口蹄疫病毒(FMDV)分子检测方法,本研究基于FMDV的3D基因,设计特异性引物和exo探针,建立了用于FMDV快速检测的等温实时荧光反转录重组酶聚合酶(Real-time RT-RPA)方法。该方法采用便携式等温扩增仪-Genie Ⅲ实时监测扩增结果,40℃20 min即可完成检测。结果显示,FMDV RT-RPA方法能够特异性扩增FMDV 3D基因,而对水泡性口炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、脑心肌炎病毒等均无扩增;以体外转录的FMDV 3D RNA作为模板,该方法在95%置信区间检出下限为1.0×10~2拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1%;使用43份含有灭活FMDV的模拟临床样品分析显示,RT-RPA对FMDV的检出率为34.9%(15/43),略低于荧光定量RT-PCR的检出率(39.5%,17/43),而两种方法的符合率为95.3%(41/43)。RT-RPA能够在6 min～16 min内完成检测,而实时荧光RT-PCR则需要30 min～51 min。本研究所建立的实时荧光RT-RPA方法反应快速,特异性强,灵敏性高,操作简单,结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie Ⅲ,组建了FMDV快速检测平台,在基层兽医部门,尤其在野外及疫情现场的FMDV检测中具有极大的应用潜力,为设备仪器有限的实验室和田间对FMDV的快速检测提供了一种有效的方法,对于条件有限地区FMD的防控具有重要意义。     

H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立快速、准确检测H3亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据GenBank中H3亚型AIV HA基因序列,设计出1对特异性引物,通过优化反应条件建立了H3亚型AIV二温式RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性检测,并对256份临床样品进行检测。结果表明,该法只能扩增H3亚型AIV,对其他亚型AIV及常见禽病病原体不扩增;对H3亚型AIV检测下限为1×10~4拷贝/μL;256份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。与普通RT-PCR相比该法节省了30min,表明所建立的H3亚型AIV二温式RT-PCR方法是一种快速、简便和特异的检测方法。     

A型塞尼卡病毒与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经优化引物浓度、退火温度等反应条件,初步建立了同时检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV的多重RT-PCR方法。利用该方法同时检测SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3等主要猪源病毒,结果显示该方法仅对SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV检测为阳性,其他均为阴性,特异性较强;SVA、O型、亚洲I型、A型FMDV重组质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的多重RT-PCR方法检测,结果显示同一反应体系中,4种重组质粒标准品的检出下限均为2.5×10~2拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,该方法重复性较好。利用本实验建立的方法对2019年采集自广西省的30份临床疑似样品进行检测,结果显示,SVA、O型FMDV的阳性检出率分别为16.67%和63.33%;未检出亚洲I型及A型FMDV;同时采用国家标准《口蹄疫诊断技术》(GB/T18935-2003)中RT-PCR方法以及文献报道的SVA套式RTPCR方法对FMDV、SVA检测,结果与本实验建立的多重RT-PCR方法检测结果的符合率为100%。本研究首次建立的多重RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为鉴别检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV提供了有效的技术方法。     

猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒福州株ORF2-7基因结构分析

用RT-PCR方法分段扩增出猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒（PRRSV） FZ株的5条cDNA片段，分别克隆到pMD-18T载体并进行测序，按顺序将这些序列进行拼接得到FZ株ORF2-7编码框序列，测序结果表明该序列长度为3272bp，与BJ 4株、VR 2332株、CH-1a 株和HB-1株核苷酸同源性分别为99.1%、98.9%、93.2%和93.2%。     

快速检测A型流感病毒的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据A型流感病毒基质蛋白（matrix protein,M）基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-18T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.998。检测结果显示,该方法的灵敏度可达10 copies/μL或1 EID50病毒且特异性良好,除A型流感病毒外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪输血传播病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。对40份实验感染样品的检测结果表明,该方法与病毒分离结果一致,比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高,特异性更强。     

绦虫催乳素基因cDNA克隆及序列分析

根据文献报道的脊椎动物催乳素基因 c DNA序列的保守区 ,设计 1对引物。提取绦虫总 RNA,采用 RT- PCR扩增绦虫催乳素基因 ,琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物 ,将回收产物连接到 p MD- 18T克隆载体 ,对待选克隆进行 PCR和酶切鉴定。阳性克隆进行序列测定 ,获得全长 893bp的 c DNA序列 ,共编码 2 2 2个氨基酸 ,其中前 2 2个氨基酸为信号肽 ,成熟蛋白共编码 2 0 0个氨基酸。将测序结果与 Gen Bank中已知序列比较 ,推导氨基酸序列并进行活性位点分析 ,所得序列与脊椎动物催乳素同源性最高 ,含有催乳素的 2个活性区域 ,证明所得到的序列就是催乳素序列。     

O型口蹄疫病毒P1-2A基因重组杆状病毒的构建及其表达

设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBac^TM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒2b基因的克隆和原核表达

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株2b基因序列,设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从PRRSV中扩增出222 bp的片段,并克隆至pMD18-T,连接到pGEX-4T-1表达载体,将阳性重组质粒pGEX-4T-2b转化到BL21(DE3),对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,所得重组蛋白的分子质量大小为35 ku,与预期结果相同,且具有良好的免疫学活性。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达载体构建

用Trizol提取O型口蹄疫病毒RNA,根据已经公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对VP1基因的引物,通过RT-PCR扩增出VP1基因,将其克隆至表达载体pET-32a中。经测序表明,目的基因VP1已正确地整合至表达质粒中。     

家蝇抗菌肽天蚕素基因的定点突变和高效表达质粒的构建

运用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)技术从家蝇体内扩增出抗菌肽天蚕素 (cecropin)基因的开放阅读框(ORF) ,与pMD 18T载体重组 ,经限制性酶切片段分析和核苷酸序列分析 ,与GenBank中报道的序列一致。根据此ORF ,重新合成 1对引物 ,并在碳末端进行定点突变 ,加上Asn编码 ,使其末端酰氨化 ,再利用半嵌套式PCR扩增出家蝇cecropin基因的成熟肽 ,与双酶切的酵母表达载体pPICZαA连接 ,经PCR和双酶切鉴定 ,成功构建了分泌型表达质粒。     

传染性支气管炎病毒DS10株S基因分析及其杆状病毒表达产物免疫原性鉴定

对肾型鸡传染性支气管炎病毒分离株Ck/Jiangsu/DS10/2008株(DS10株)S基因进行扩增、克隆和序列测定,并与GenBank中的其他25株参考株构建进化树进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9昆虫细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。S基因序列分析表明,S基因高变区域主要集中在157～230位、349～433位、787～886位之间,裂解位点序列为SHRRRRμSI。遗传进化分析表明,DS10与Vic株处于同一分支,而与H120等常用疫苗株相距较远。经间接免疫荧光检测表明,S蛋白在Sf9细胞中得到表达,琼扩试验验证表达产物具有良好的反应性,表明所表达的S蛋白具有良好的生物学活性。本研究表达的S蛋白可为传染性支气管炎诊断抗原的研制、新型疫苗的开发等提供基础材料。     

鹅bcl-2基因部分cDNA的克隆与序列分析

细胞凋亡是基因活动引起的级联反应的结果。现已发现大约有30多种分子专门参与细胞凋亡调控，其中bcl-2家族是一类主要的细胞内调控物质，由相应的bcl-2基因家族编码。自Tsujimoto等首先克隆人bcl-2基因以来，随后的一系列研究发现bcl-2蛋白的生理功能主要是阻遏细胞凋亡、延长细胞寿命，这些研究主要集中于人、