稻瘟病菌Rab族蛋白的结构及演化分析

运用生物信息学方法,进行稻瘟病菌基因组中假定的Rab蛋白结构分析、建立系统进化树、预测Rab蛋白可能的组织和时空表达特点.结果表明,稻瘟病菌基因组共有11个假定的Rab蛋白成员.这些蛋白均含Ras超家族典型的结构域,但具有可以区别于Cde42等Rho家族小GTP酶的特征,部分Rab成员表现出组织与时空表达的特异性;进一步系统进化分析表明,23种真菌Rab蛋白在进化树上聚成8个分枝,并显示出Rab蛋白的分化可能早于真菌种类的分化.     

利用生物信息学方法鉴定和分析禾谷炭疽菌Rab蛋白家族

Rab蛋白作为分子开关,调控着丝状真菌中囊泡运输的各个过程。为明确禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)中Rab蛋白家族成员的数量和理化特征,本研究利用生物信息学的方法对禾谷炭疽菌中的Rab蛋白进行比对搜索,并对得到的Rab蛋白进行理化性质和系统进化分析,以期望为进一步阐明其功能提供理论指导。结果表明,禾谷炭疽菌中共有10个Rab蛋白候选基因,都编码小分子的亲水蛋白,编码产物都定位于胞内具有膜结构的细胞器上,其中有一半为稳定蛋白。此外,该Rab蛋白家族的绝大多数成员在丝状真菌中的进化是保守的,都具有保守的结构域,但是该家族个别成员与同属的黄瓜炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)中的同源蛋白的进化距离较远,暗示了禾谷炭疽菌为了适应环境和更好地侵染植物进化出了可能具有特异性功能的Rab蛋白。本研究的结果将为深入明确Rab蛋白家族的具体功能奠定基础,期望为进一步设计更加合理有效的玉米炭疽病防治策略提供新思路。     

苦瓜McAGD8和小G蛋白McRABD2c基因全长cDNA的分离及序列分析

构建并筛选苦瓜成熟果实c DNA文库,分离获得2个全长c DNA序列(命名为McRABD2c和McAGD8)。序列分析结果表明:McAGD8长度为1 695 bp,含有1个1 209 bp开放阅读框,编码403个氨基酸,该蛋白含有1个保守的Arf GAP结构域,与黄瓜Cs AGD8-like具有90%的同源性,同甜瓜Cm AGD8具有89%的同源性。McRABD2c长度为1 166 bp,含有1个609 bp开放阅读框,推测编码202个氨基酸,该蛋白含有Rab家族保守的Rab SF(Rab SF1-Rab SF4)模体及特有的Rab F模体(Rab F1-Rab F5);5个G结构域和2个构象变构域(SwitchⅠ、SwitchⅡ)及C末端的CCX序列,同Cs RABD2C-like同源性高达99%。氨基酸同源比对及进化分析结果表明Mc RABD2属于小G蛋白,而McAGD8属于Arf小G蛋白下游的效应基因。     

在大肠杆菌中高效表达人粒-巨噬细胞集落刺激因子可溶性融合蛋白的研究

通过人粒－巨噬细胞集落刺激因子与疏氧还蛋白融合的形式，利用ＰＴｘＦｕｓ表达载体，高效地表达了其可溶性融合蛋白，该融合蛋白具有较高的热稳定性。     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1表达产物的亚细胞定位

甘蔗锌指蛋白ShSAP1可能参与了甘蔗成熟与逆境应答的过程。为了研究ShSAP1的功能,可通过亚细胞定位研究ShSAP1的定位特点。首先将ShSAP1基因的编码区序列连接到植物表达载体pCAMBIA1302中,构建ShSAP1与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pCAMBIA-ShSAP1,然后采用基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下观察ShSAP1与GFP融合表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位,结果表明ShSAP1-GFP融合蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。     

水稻抗白叶枯病基因xa5的原核表达及蛋白纯化

水稻是重要的粮食作物,其产量高低与病虫害等因素密切相关,由黄单胞杆菌引起的水稻白叶枯病是导致水稻产量减少的主要病害之一。控制白叶枯病最安全、经济有效的方法是培育抗病品种,隐性抗病基因xa5是重要的水稻白叶枯病抗性基因。通过构建显性及隐性xa5基因的原核表达载体(PGEX-4T-1-Xa5和PGEX-4T-1-xa5),转化大肠杆菌BL21,经0.2 mmol/L IPTG 28℃ 诱导4 h,表达显性Xa5和隐性xa5蛋白;结合western-blotting分析,结果表明表达的蛋白是带有GST标签的融合蛋白,最后利用谷胱甘肽亲和层析柱将蛋白纯化,为后期研究xa5基因的功能提供基础。     

橡胶树HbEBP1蛋白亚细胞定位初步研究

利用融合PCR法构建HbEBP1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体,成功转化拟南芥,借助激光共聚焦显微镜检测HbEBP1-EGFP融合蛋白在转基因植株根细胞中的表达及分布.结果显示:在转基因植株根中观察到强烈荧光信号,并分布于细胞质与细胞核中.结果证实了HbEBP1蛋白同时定位于细胞质与细胞核中.     

大豆24kDa油体蛋白与人bFGF融合基因转化拟南芥的研究

为探索大豆油体蛋白与人bFGF蛋白在植物油体中融合表达的可行性,以大豆总DNA为模板,通过PCR扩增得到大豆油体蛋白基因（Ddoil）及启动子（Ddprm）,构建Ddprm启动的Ddoil基因与植物偏好密码子改造的bFGF基因融合表达载体p1390Ddprm-Ddoil-bFGF,花侵染法转化拟南芥,对T2代拟南芥抗性植株基因组进行PCR检测,对种子总蛋白进行SDS-PAGE分析、Western blot检测、ELISA检测及细胞活性测定,为bFGF在其他油料作物的油体系统的表达提供了参考。     

甜菜小G蛋白BvRab基因家族的全基因组鉴定及生物信息学分析

【目的】在全基因组范围内鉴定甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员,为研究甜菜小G蛋白BvRab基因家族功能奠定基础。【方法】本研究利用生物信息学手段对甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员进行筛选鉴定并进行理化性质、基因结构、蛋白保守基序、系统进化、染色体定位及共线性、启动子顺式作用元件和蛋白质互作预测分析。【结果】共鉴定到58个甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员。同一类型中的不同基因具有较为一致的外显子和内含子结构,家族成员共有5个蛋白保守基序;甜菜小G蛋白BvRab基因家族包含8个亚家族;家族成员不均匀地分布在甜菜的9条染色体上;BvRab基因家族成员与番茄、拟南芥中的小G蛋白Rab基因家族亲缘关系较近,与水稻中的小G蛋白Rab基因家族亲缘关系较远;BvRab基因家族成员启动子中含有多个激素应答元件和逆境应答元件;BvRab蛋白与参与植物生长发育及逆境应答相关的多种转录因子相互作用。【结论】本研究鉴定出58个BvRab基因家族成员,该基因家族成员可能在植物生长发育及逆境应答方面发挥重要作用。     

利用酵母双杂交系统鉴定玉米Pto蛋白与Pti1蛋白间的相互作用

玉米类Pto以及类Pti1基因参与多种逆境胁迫的信号传导。本研究分别将玉米ZmPto基因、ZmPti1a和ZmPti1b基因插入酵母表达载体pEG202和pJG4-5中,利用酵母双杂交的方法验证玉米类Pto以及类Pti1蛋白的相互作用。结果表明,无论是携带空载体还是携带一个(ZmPti1或ZmPto)融合蛋白的菌株都不能激活报告基因,只有同时携带ZmPti1和ZmPto蛋白的菌株可以激活报告基因,初步确定ZmPto蛋白与ZmPti1蛋白存在相互作用。     

橡胶树炭疽菌CsHog1基因的克隆和原核表达分析

HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能,但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能和调控机制,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsHog1基因,构建GST-CsHog1融合表达载体,利用SDS-PAGE和WesternBlot检测蛋白表达情况。结果表明:橡胶树炭疽菌(C.siamense)的CsHog1基因大小1383 nt,编码459个氨基酸,包含5个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域;聚类分析显示橡胶树炭疽菌的CsHog1基因编码的氨基酸序列与黄瓜炭疽菌的ClOsc1(Hog1同源基因)同源性最高。所构建的蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;温度16、25、28℃)均可较好诱导表达,GST-CsHog1融合蛋白大小约为70 ku。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。     

稻瘟病菌MoYpt5蛋白互作网络预测

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)共有11个假定的Rab蛋白家族成员,本文选取了MoYpt51(MGG_06241)和MoYpt52(MGG_01185)进行了生物信息学分析。通过搜索多个大型蛋白互作数据库和文献,共得到数百个与核心蛋白互作的蛋白和互作对。利用信息处理技术和高效制图平台将这些蛋白互作对构建成互作网络,得到若干个具有生物学意义的模块。结果表明,筛选得到的互作蛋白中,有的参与了蛋白降解的泛素途径(MGG_04053等)、囊泡介导的蛋白胞内运输(MGG_01238等),有的在蛋白、染色体的组装和修饰等过程(MGG_03677等)起重要作用。大部分假定互作蛋白定位于细胞质和质膜上,为其与目标蛋白互作提供了空间可能性。     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5′非翻译区(5′ Untranslated region,5′-UTR)、226bp的3′非翻译区(3′ Untranslated region,3′-UTR)和2 079bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码75.1kD的蛋白质。5′-UTR中含有12bp的uORF (Upstream open reading frame),编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a(+)-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E. coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

Functional Analysis of Three Rice Chloroplast Transit Peptides

Chloroplast transit peptides (CTPs) can be used to transport non-chloroplastic proteins into the chloroplasts. Here, we studied the CTPs of three rice (Oryza sativa L.) chloroplast-localized proteins and found that their CTPs could be used to transport non-chloroplast-localized proteins into the chloroplasts. Fusion proteins lacking the CTP remained located in the cytoplasm. Furthermore, we constructed green fluorescent protein fusion vectors with the three CTPs and three non-chloroplast-localized proteins, Ghd10, MULTI-FLORET SPIKELET1 (MFS1), and SHORTENED UPPERMOST INTERNODE 1 (SUI1). After transforming these constructs into rice protoplasts, the fusion proteins all localized in the chloroplasts. Collectively, our results showed that these CTPs can transport non-chloroplast-localized proteins into the chloroplasts, and more importantly, these CTPs can be applied to engineer chloroplast metabolism.     

植物小G蛋白功能的最新研究进展

小G蛋白超家族包括Ras、Rab、Rho、Arf和Ran亚家族，不同成员间在结构和功能方面又呈现明显的多样性。小G蛋白作为重要的分子开关，其结构域主要包括4个鸟苷酸(GTP/GDP)结合域、1个效应区，其鸟苷酸结合域起着关键作用且保守性最高，在植物、动物和酵母中均有较高的保守性。小G蛋白成员凭借其多样性和不同鸟苷酸结合态的功能调控(结合GTP时为活性状态，而结合GDP时为非活性状态)，参与多种细胞生命活动，履行不同的生物学功能，例如基因表达调控，细胞骨架重组，囊泡运输的调节，出芽过程，核-质运输及微管形成     

新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的原核表达、蛋白纯化及其活性鉴定

 通过PCR方法从pCAMBIA1305载体上克隆了新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的全编码序列,并插入到原核表达载体pET30a（+）中,构建了重组质粒pET30a nptⅡ。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌,经IPTG诱导,获得了相对分子量为35 kD的表达蛋白,约占全菌总蛋白的45％。表达蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。用5 mmol/L 二硫苏糖醇和1％十二烷基肌氨酸钠变性溶解包涵体,经透析后复性获得了可溶性重组蛋白。将可溶的表达蛋白用Ni2+ NTA亲和层析纯化,获得纯化的NPTⅡ蛋白,电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度达95％以上。体外活性检测显示,NPTⅡ蛋白具有良好的生物活性,在浓度30 μg/mL以上时可使卡拉霉素失去抑菌活性。     

小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检测

转录因子在提高植物抗性中起着重要的作用。本实验从小麦中克隆得到一个新的具有DUF822保守域的转录因子基因 TaBS1。为进一步研究该转录因子在参与植物胁迫信号调控中的作用以及蛋白本身的结构、功能和活性等,将 TaBS1基因构建到原核表达载体pET28a(+)上。在终浓度为1 mmol·L^-1 IPTG诱导2 h的条件下,得到融合蛋白 HisTaBS1,并用Western blot确定所表达的蛋白确实为融合蛋白 HisTaBS1。     

甘蔗单糖转运蛋白基因ShPST2a克隆及亚细胞定位

参照GenBank中公布的甘蔗品种Q117ShPST2a基因序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法从甘蔗成熟茎秆中扩增出甘蔗单糖转运蛋白的基因序列,命名为ShPST2a,该序列长2 455 bp,包含1个2238 bp阅读框,编码745个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对ShPST2a编码蛋白进行亚细胞定位研究.结果表明,该基因编码蛋白定位于细胞膜,符合细胞膜转运蛋白的特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础.