甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1表达产物的亚细胞定位

甘蔗锌指蛋白ShSAP1可能参与了甘蔗成熟与逆境应答的过程。为了研究ShSAP1的功能,可通过亚细胞定位研究ShSAP1的定位特点。首先将ShSAP1基因的编码区序列连接到植物表达载体pCAMBIA1302中,构建ShSAP1与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pCAMBIA-ShSAP1,然后采用基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下观察ShSAP1与GFP融合表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位,结果表明ShSAP1-GFP融合蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。     

大豆7S蛋白β亚基基因RNAi表达载体构建

以大豆7S蛋白β亚基基因为靶基因(基因编号:AB030840),利用RT-PCR克隆得到大豆7S蛋白β亚基基因核心序列398 bp,构建了以抗除草剂基因BAR为筛选标记的安全植物RNAi表达载体BAR-7αp-β.分子生物学检测表明7S蛋白β亚基基因的表达载体构建成功.研究结果为应用RNA干扰技术降低大豆过敏原,提高大豆蛋白品质奠定了基础.     

草莓NCED基因正反义表达载体和RNAi载体的构建

根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498）,克隆NCED基因开放阅读框,将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间,构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段,以植物表达载体pBI 121为基础,以pCAMBIA2301作为中间载体,通过多次酶切和连接,成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后,成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。     

块根特异启动的木薯SBE I、SBE Ⅱ基因 RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

甘薯IbNPR1基因表达载体的构建及转化烟草

为了研究甘薯NPR1基因在转基因植物广谱抗病中的应用,利用前期克隆的甘薯NPRI基因,以pCAMBIA1300质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动IbNPR1基因的植物表达载体pCAMBIAl300+IbNPRl;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化.经PCR检测,IbNPR1基因已整合到烟草基因组中.     

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。     

香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因RNAi载体的构建

采用PCR技术扩增得到胰蛋白酶抑制剂KTi基因正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GUS基因片段,将其分别连入克隆载体pMD18-T Vector中.然后以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,通过AHLG作为中间载体,根据RNAi原理将组成RNAi 结构的4个目的片段分别连入其中,成功构建了种子特异性RNAi表达载体p1301-KTiRi.研究结果为RNAi技术在大豆品质改良中的应用提供了基础.     

根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建

针对根结线虫16D10基因和花生△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的核酸序列设计了两条含有GUS内含子的RNA干扰结构序列.以pBS-T质粒为中间载体,将这段序列连接进植物转化载体pRI 101-AN中,获得针对两个基因的RNAi载体.经SalI和KpnI双酶切验证,目的序列已准确插入目标载体.此载体可用以培育抗根结线...     

水稻隐花色素基因Cry1a/Cry2/Cry1bRNAi表达载体构建及遗传转化研究

构建一个包含3个水稻隐花色素基因片段的RNAi表达载体pSC 1301-347-Cry1aCry2Cry1b并转化水稻,以期导致Cry1a、Cry1b与Cry2集体沉默,观察它们对水稻重要农艺性状的影响.结果表明,转基因水稻开花期显著延迟,结实率骤降,株高增加,剑叶变短,谷粒变长、变宽;而剑叶宽、穗长与对照无显著差异.     

大豆Gy1基因种子特异性表达载体的构建及在玉米中的转化

实验构建了2个大豆贮藏蛋白Gy1基因种子特异性表达载体,并将其分别转入玉米愈伤组织中。载体1以潮霉素为筛选标记,将Gy1基因片段插入到含有种子特异启动子的植物表达载体pCAMBIA1301-7αP上,得到种子特异性表达载体pCAMBIA1301-7αP-Gy1;载体2以BADH为筛选标记,将Gy1基因插入到带有耐盐基因BADH的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH上,得到安全性无抗生素选择标记的种子特异性表达载体pCAMBI-A1301-sbeⅡb-Gy1。通过农杆菌介导法将其分别导入玉米自交系H99的愈伤组织中,共获得132株再生植株;经过PCR检测,初步证明获得了34株转基因阳性植株。     

玉米特异启动子驱动下结核hsp65基因植物表达载体构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-Hsp65联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。结果表明：成功构建了pC1300GHsp65质粒,酶切鉴定得到3 Kb和8.6 Kb两条带,测序分析表明,克隆的Hsp65与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒条带大小与预期结果相符合。结果显示,已成功构建和转化了pC1300GHsp65质粒,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础。     

GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗

利用经人工改造的gna基因分别与Ubi、Rbcs启动子组合,构建抗虫植物表达载体pUNG和pRNG,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经PPT筛选和PCR检测,获得Ubi-gna转基因植株124株,Rbcs-gna转基因植株35株。对部分转基因植株进行RT-PCR检测,初步证明外源基因已经整合到甘蔗基因组中,并得到有效表达;对RT-PCR阳性植株进行GNA(植物外源凝集素)活性测验,结果表明,甘蔗叶片表达的凝集素可以使健康公鸡的红细胞凝集,初步证明表达的GNA具有正常的生物学活性。     

Cry1Ac和sck双价抗虫基因遗传转化甘蔗的研究

将双价抗虫基因,即修饰的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(Cry1Ac)和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甘蔗优良品种ROC22,获得潮霉素抗性转化植株95株,35株能检测到外源抗虫基因,获得的13株RT-PCR双基因均呈阳性的甘蔗植株,斑点杂交检测有4株呈阳性。结果表明:外源抗虫基因已导入甘蔗基因组中。     

抗花叶病转SrMV-P1基因甘蔗的活性氧代谢分析

转SrMV-P1基因甘蔗经过2个世代的试验,表现出对甘蔗花叶病一定的抗性,但不同转基因无性系中,其抗性呈现出不同程度的分化.本研究以受体材料(FN95-1702)和空转对照P7(未插入外源基因SrMV-P1的载体)为对照,以国家发明专利授权的转基因无性系TF53和T64为试验材料,研究其在不同甘蔗花叶病毒剂量,以及载体效应和外源基因效应作用下的活性氧代谢分析,从代谢水平上解析转基因材料抗性呈现不同分化规律的机理.结果表明:转基因无性系在较高病毒剂量胁迫下,通过活性氧代谢相关指标的变化对病毒侵染起到应激作用;载体效应和外源基因效应对活性氧代谢影响存在一定差异,这段差异时期也主要发生在较高病毒剂量的情况下;外源基因对不同无性系中活性氧代谢的影响,表现在高病毒剂量的作用下,其活性氧代谢相关指标在变化幅度上存在一定差异,导致其对病毒的抵御能力上的不同,这可能是转SrMV-P1基因抗性分化的生理基础.     

玉米耐冷基因ZmCOLD1的结构和表达模式分析

低温冷害是影响玉米生产的重要环境因素之一。基于水稻中调控耐低温的OsCOLD1基因编码序列,通过Blast比对获得高度同源的玉米ZmCOLD1基因编码序列,进而对ZmCOLD1基因的分子特征和编码蛋白的亚细胞定位进行分析,并进行ZmCOLD1基因过表达遗传转化载体的构建。结果表明,ZmCOLD1基因编码区长度为1 647 bp,编码548个氨基酸,理论等电点(pI)4.95,估计分子量为137 457.13 Da,属疏水蛋白。利用ClustalX进行蛋白质序列的比对,进行ZmCOLD1基因系统进化树分析,ZmCOLD1氨基酸序列与水稻的亲缘关系较近。通过构建目的蛋白与GFP融合的表达载体pCAMBIA1302-GFP-ZmCOLD1并注射烟草,发现ZmCOLD1蛋白主要集中在细胞质膜中。     

香蕉NPR1基因的克隆及植物表达载体构建

病程相关基因非表达子(NPR1)是植物抗病信号传导的关键基因。以香蕉抗病香蕉品种为材料,根据NPR1基因序列在保守区设计引物,从香蕉cDNA中克隆获得NPR1基因片段,以RACE的方法克隆获得香蕉NPR1基因的全长,并命名为GCT119-NPR1。香蕉GCT119-NPR1基因最大阅读框(ORF)为1 707 bp。生物信息学分析结果表明,该基因含有ANK和BTB两个结构域,其中ANK结构域是NPR1基因中非常重要的结构域,在蛋白质相互作用中起着至关重要的作用。同源性分析表明,该基因与已克隆发表的NPR1基因氨基酸序列同源性为67%~82%。将其构建植物表达载体,为下一步转化工作奠定基础。     

象耳豆根结线虫Me-mapk1基因的克隆及RNAi分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是线虫体内信号转导的重要组分,在生长发育过程中具有重要作用。本研究从象耳豆根结线虫中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1c DNA序列,该序列全长1 369 bp,包含1个1 185 bp的完整开放阅读框,推导编码394个氨基酸,蛋白质分子量为45.39 ku。同源性搜索比对结果发现,该基因编码的蛋白序列与南方根结线虫MI-MAPK1具有99%的一致性。通过构建原核表达载体p ET-32a-MAPK,在IPTG的诱导下得到70 ku左右的特异融合蛋白(包括大小约26 ku的标签序列)。利用RNAi技术对象耳豆根结线虫二龄幼虫Me-mapk1基因进行沉默,线虫诱导番茄根结形成的数量显著减少,推测Me-mapk1基因的下调表达有可能影响象耳豆根结线虫二龄幼虫(J2)的生长发育。