甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1表达产物的亚细胞定位

甘蔗锌指蛋白ShSAP1可能参与了甘蔗成熟与逆境应答的过程。为了研究ShSAP1的功能,可通过亚细胞定位研究ShSAP1的定位特点。首先将ShSAP1基因的编码区序列连接到植物表达载体pCAMBIA1302中,构建ShSAP1与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pCAMBIA-ShSAP1,然后采用基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下观察ShSAP1与GFP融合表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位,结果表明ShSAP1-GFP融合蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。     

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB，通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织，经过除草剂PPT三次连续筛选，共获得67株抗性植株，经PCR扩增检测，得到22株阳性植株，并对其进行RT-PCR检测，证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中，且得到了有效的表达。     

CryIA(c)基因植物表达载体的构建及转基因甘蔗的获得

构建了玉米UBI启动子驱动Bt CryIA(c)基因的高效植物表达载体pUBTC,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT 3次连续筛选,获得89株抗性植株,经过PCR扩增检测,得到71株阳性植株,对其中7株进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功的整合到甘蔗基因组中,并得到有效的表达。     

花生FAD2基因RNAi载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析

在构建了以花生△12脂肪酸去饱和酶（FAD2）基因自身启动子驱动、有内含子间隔的该基因编码序列反向重复片段的RNA干扰载体的基础上,对上述干扰载体进行了农杆菌介导的花生胚小叶的遗传转化,以期特异调控花生籽粒中油酸、亚油酸含量。 在2个受体品种中获得105株抗性再生植株,用两对引物对其进行了PCR扩增,其中32株初步证实为转基因植株。采用近红外分析仪对转基因T1籽粒油酸和亚油酸含量的检测表明,转基因株系内油酸/亚油酸比值的变异高于对照,多数转基因株系油酸亚油酸比值平均数也显著高于对照。     

亚麻木质素合成相关基因COMTRNAi表达载体构建及转化

以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。     

两步法构建灰飞虱RNAi载体及水稻遗传转化

灰飞虱不仅直接危害水稻,还是水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病的传播媒介。为了探索防治灰飞虱及由灰飞虱引起的水稻病毒病的方法,本研究利用两步法快速高效构建灰飞虱RNAi载体,并应用于水稻遗传转化。针对灰飞虱的激活性蛋白激酶C受体(RACK)基因设计了一对特异性引物,通过PCR扩增一段200 bp的干扰片段,将干扰片段克隆到入门载体p ENTR,再经过LR反应使入门载体上的干扰片段整合入目的载体p ANDA,形成RNAi载体p ANDA-RACK,通过农杆菌EHA105介导的水稻转化法转入武陵粳1号,获得20株经鉴定为阳性的转基因植株,为防控灰飞虱及其传播的水稻病毒病提供了珍贵材料。     

农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因的研究初报

为了研究以小麦茎尖为受体进行农杆菌转化的可行性,选用小麦品种H6756,以茎尖为受体进行了农杆菌转化.构建了含有拟南芥逆境诱导转录因子DREB1A及除草剂bar基因的表达载体pC3300IS-DREB1A,酶切鉴定此载体,结果证明其连接完全正确,具有转录和表达的功能.农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因,共获得247株转化苗.转化苗经除草剂筛选,获得66株抗性苗,对抗性苗进一步进行PCR检测,有30株抗性苗扩增出特异性片段,转化率达到12.1%,初步说明本试验中以小麦茎尖为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的.     

甜菜磷酸蔗糖合成酶的转基因研究

将甜菜磷酸蔗糖合成酶(Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS)基因构建到植物表达载体pBI121上,利用农杆菌介导法对甜菜叶柄进行遗传转化.通过对转基因体系的优化,确定了农杆菌浓度OD.为0.6时,叶柄外植体经过2d的预培养,农杆菌侵染5mn,侵染受体共培养4d后,所获得的Kana抗性芽率最高.在所获得的27株Kana抗性植株中,通过提取甜菜基因组DNA及PCR鉴定,有8株成功整合了BvSPS基因,阳性率达到29％.     

甘蔗GA20氧化酶基因片段克隆及序列分析

以甘蔗茎尖为材料,根据其它植物的GA20氧化酶基因(GA20-oxidase)氨基酸保守区,设计一对简并引物.通过RT-PCR扩增得出1条约740 bp大小的DNA片段.将其克隆至pMD18-T载体上,而后对重组克隆进行测序,结果表明所获得的甘蔗GA20氧化酶基因片段由740碱基组成,编码246个氨基酸.该基因片段具有其它植物GA20氧化酶基因中存在的保守区:同时,与多种单子叶植物的GA20氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性在80%和75%以上.聚类分析显示,甘蔗和玉米最先聚类,推测在进化上具有较近的亲缘关系,其次与高梁、结缕草聚类,然后再与水稻聚类,其中进化关系最远的是簇毛麦和小麦.     

甘蔗健康种苗培育体系的建立

通过热处理、温热处理结合茎尖分生组织培养建立有效的甘蔗(Saccharum L.)健康种苗生产的技术体系。以经过热处理和温热处理的甘蔗带芽茎段萌生的腋芽为外植体,取其茎尖分生组织接种于MS BA1.0mg/L NAA0.1mg/L PVP200mg/L 蔗糖30g/L的培养基上培养10￣20d可诱导其产生完整的小芽,再把产生的新芽切割下来接种于MS 6BA1.0mg/L KT0.5mg/L 蔗糖30g/L的培养基上培养20d后便可形成由3￣5个芽组成的丛生芽,丛生芽在继代培养过程中每15￣20d可增殖3￣5倍。把丛生芽分割成单株并接种于1/2MS NAA1mg/L 蔗糖20g/L培养基上培养10￣20d可诱导小芽形成完整的根系,小植株移栽成活率可达98%。植株生长健壮、整齐、无变异,经分子检测证明小植株能脱去宿根矮化病和花叶病的病原。该体系的建立为甘蔗健康种苗的工厂化育苗奠定了坚实的基础。     

20个甘蔗品种（系）的抗旱性比较

干旱是限制我国甘蔗产量提高的主要原因。采用桶栽和人工控水的方法,对云南省甘蔗主产区临沧市选取的20个甘蔗品种（系）进行抗旱性分析,通过测定苗期和分蘖期的8个抗逆生理指标,以及分蘖率、成活率和株高3个生长指标,采用模糊隶属函数、主成分分析和系统聚类分析方法对各甘蔗品种（系）的抗旱性进行综合评价。结果表明,干旱胁迫后,甘蔗叶片相对含水量、叶绿素含量、甘蔗分蘖率、株高和成活率呈下降趋势,而甘蔗叶片丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量、质膜透性、SOD和POD酶活性则呈上升趋势。通过模糊隶属函数、主成分分析和系统聚类分析可将20份甘蔗品种（系）材料分为3类,其中7个为抗旱品种（系）,6个为中等抗旱品种（系）,7个为不抗旱品种（系）;根据抗旱综合值,7个抗旱品种（系）的抗旱能力排名为：‘桂糖06-2081’>‘柳城05-136’>‘福农38’>‘柳城03-1137’>‘德蔗03-83’>‘云蔗05-49’>‘福农40’。相关分析表明,与甘蔗抗旱性呈显著正相关的指标分别为成活率、株高和叶片相对含水量,呈显著负相关的指标分别为质膜透性、脯氨酸和可溶性糖含量。     

氮素形态与吡虫啉对甘蔗根系和地上部生长的影响

本研究通过水培的方式,探究不同形态氮素以及不同形态氮素和新烟碱类杀虫剂吡虫啉（IMI）处理对甘蔗生长、根系伤流强度和根系形态的影响。研究结果显示：与缺氮（CK）相比,添加铵态氮（A）、硝态氮（N）或铵态硝态氮（AN）能够显著提高甘蔗植株的株高和茎径（P<0.05）,其中株高增高了大约3倍,茎径增粗2~3倍,与硝态氮相比,铵态氮能促进甘蔗茎径变粗、鲜重增加以及侧根和不定根的形成;硝态氮为氮源可促进甘蔗根系的纵向生长;铵态氮和硝态氮共存时甘蔗根系总长、根表面积、根系体积以及伤流液强度大于单一氮源处理。添加吡虫啉促进了缺氮条件下甘蔗的生长;与对应的氮素处理组相比,吡虫啉和氮素共处理组甘蔗的鲜重均增加,其中A+IMI处理比A处理增加17.69%,N+IMI处理比N处理增加46.19%,AN+IMI处理比AN处理增加29.43%,在硝态氮存在时差异达到显著水平（P<0.05）;此外,吡虫啉和硝态氮共存显著提高了甘蔗根系总长、根表面积和伤流液强度（P<0.05）。结果表明铵态氮和吡虫啉共施对甘蔗整体的生长最为有利,吡虫啉和硝态氮共施可促进甘蔗鲜重增加以及根系的生长。本研究为甘蔗氮肥施用以及吡虫啉和氮肥在甘蔗中的共施提供重要的理论依据,同时,为“药肥一体化”技术在甘蔗上的应用提供借鉴。     

海南50个甘蔗品种黄叶病毒的分子鉴定

为明确国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种在海南省被甘蔗黄叶病毒(SCYLV)侵染情况及病毒基因型类型,从集成示范及区试的50个甘蔗品种上采集带有显著病症或不显病症样品50份,采用特异引物通过RT-PCR方法进行甘蔗黄叶病毒检测和病毒基因型鉴定。结果表明:50个甘蔗品种中有31个被检测到SCYLV,检出率为62%;病毒基因型有古巴(CUP)基因型、巴西-秘鲁(BAR-PER)基因型和留尼汪岛(REU)基因型3种,主要以CUP基因型为主,占58.06%,其次是BAR-PER基因型,占51.61%,REU基因型最少,占29.03%;未发现CHN1、CHN2、CHN3基因型。另外,不同基因型混合侵染现象普遍存在,总混合侵染率达32.26%。可见,海南国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种严重感染甘蔗黄叶病毒(SCYLV),且存在不同基因型混合侵染,建议推广种植脱毒种苗来控制甘蔗黄叶病的发生。本研究为在海南蔗区推广和种植甘蔗脱毒种苗及抗病育种提供了理论支持。      

烟酰胺对甘蔗锰毒的缓解效应

本文揭示锰毒胁迫下甘蔗根分泌烟酰胺及其作用,为解决甘蔗锰毒问题提供依据。采用液质联用技术分离、鉴定甘蔗分泌物中的烟酰胺;采用水培试验方法,在培养液中添加烟酰胺研究烟酰胺对锰毒引起的甘蔗根伸长、胼胝质和活性氧积累及其相关酶活性等的影响。结果液质联用质谱图上显示,甘蔗根系分泌物中存在烟酰胺质谱峰,且锰胁迫条件下烟酰胺信号更强;锰毒胁迫下甘蔗根系伸长受阻、根系活力降低,根尖积累胼胝质,根系中过氧化氢、活性氧及丙二醛含量和超氧化歧化酶、氧化氢酶、抗坏血酸氧化物酶活性显著提高;在锰胁迫下添加于培养液中的烟酰胺显著降低或消除锰的上述影响。可见,过多的锰诱导甘蔗根系分泌烟酰胺,而烟酰胺显著抑制过多的锰对甘蔗生长及过氧化胁迫伤害。     

甘蔗大型机械化收获模式对蔗地土壤物理性状和宿根蔗产量的影响

为明确机械收获对蔗地土壤物理性状和宿根蔗产量的影响,以消除蔗农对大型机械收获系统对甘蔗耕层土壤严重压实的顾虑。以广西红壤坡耕地为研究对象,设置机械收获和人工收获2种处理,研究机械收获对耕层土壤物理性状和宿根蔗产量的影响。结果表明：蔗垄0~40 cm土层,土壤容重、贯入阻力、抗剪强度、田间持水量和总孔隙度等土壤物理性状在机械收获和人工收获间均无显著差异。蔗沟0~20 cm土层,机械收获后,土壤紧实度、贯入阻力和抗剪强度显著提高,总孔隙度和通气孔隙度下降。同人工收获相比,机械收获过程中,机具行走对蔗沟土壤造成压实,但对蔗垄土壤影响不显著。蔗垄土壤紧实度在垂直梯度上存在2个明显交替变化的界面,0~20 cm土层以人工收获的土壤紧实度较高,20~40 cm土层以机械收获的土壤紧实度较高。第1年宿根季和第2年宿根季人工收获处理蔗茎产量均高于机械收获处理,但差异不显著。综上所述,在固定道技术下,甘蔗机械收获对蔗垄土壤物理性状和宿根蔗产量的影响不显著。本研究为规范甘蔗机械收获操作,减少大型机械对蔗地土壤压实提供了科学依据。     

叶面喷施海藻提取物对甘蔗干旱胁迫的缓解效应

为研究叶面喷施海藻提取物对干旱胁迫下甘蔗叶片生理参数及植株形态指标的影响,以‘YT159’和‘ROC22’两个品种甘蔗为试验材料,采用盆栽方法,设置正常灌溉组（C）和干旱胁迫组（D）,分别通过喷施不同用量（SE1、SE2）海藻提取物,测量分析植株形态指标株高、茎径、植株鲜重以及叶片生理参数,包括水分参数、抗氧化酶活性等。结果表明：正常灌溉组喷施海藻提取物的处理（C+SE1、C+SE2）甘蔗叶片生理参数以及形态指标与不施用海藻提取物处理相比差异不显著。干旱胁迫组喷施海藻提取物（D+SE1、D+SE2）与不喷施海藻提取物的C相比,叶片脱水速率、电导率、脯氨酸含量显著降低,叶片超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性、相对含水量、植株鲜重显著增加,同时抗旱系数显著提高,2个品种中‘YT159’提高幅度较大,‘ROC22’提高幅度相对较小。因此,叶面喷施海藻提取物能显著改善干旱胁迫下甘蔗叶片生理参数和植株形态指标,提高植株鲜重,从而缓解干旱胁迫对甘蔗造成的伤害,提高甘蔗抗旱能力。     

引进美国甘蔗种质工艺品质演进分析及发掘

本研究主要基于投影寻踪分类法（PPC）对引进美国甘蔗种质主要工艺品质性状进行世代演进和种质评价分析。根据育成或改良年代（10~20 a为时间界点）把引进的58份美国甘蔗种质划分4个改良世代,基于大田试验,对甘蔗锤度、甘蔗蔗糖分、蔗汁蔗糖分、甘蔗纤维分、甘蔗简纯度等5个重要工艺品质性状指标进行方差、投影寻踪分类和聚类分析,以揭示其世代演进特征和筛选工艺品质优异种质资源用于杂交育种。方差分析表明,世代内和世代间各种质资源工艺品质性状存在显著差异（P<0.05）,变异系数在2%~20%之间,其中甘蔗蔗糖分、蔗汁蔗糖分和简纯度3个品质性状还存在世代和月份间的显著交互作用。投影寻踪分类法评价分析表明,不同世代美国甘蔗种质资源投影值差异显著,其中以第1代最低,依次增加,第4代最高;投影方向以甘蔗蔗糖分最高,依次为蔗汁蔗糖分和甘蔗锤度,简纯度和纤维分最低。根据投影值大小的聚类分析表明,58份种质可以划分为4类。筛选了主要工艺品质性状优良的甘蔗种质18份（第Ⅱ类）用于杂交育种,其中来自第4代的材料有6份,占第4代材料总数的46.15%;来自第3代的材料有10份,占总数的37.07%;来自第2代的材料有1份,占总数18.18%;第一代材料未筛选出品质优良种质资源。以上结果可以看出,美国甘蔗种质资源主要工艺品质改良显著,随着世代演进而显著提升。表现优异外引种质以第4代所占比重最高,依次递减,第一代最少,优异种质多来源于演进次数最多的世代;投影寻踪分类法可作为甘蔗改良效果和种质资源评价研究的另一途径。