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以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。 相似文献
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灰飞虱不仅直接危害水稻,还是水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病的传播媒介。为了探索防治灰飞虱及由灰飞虱引起的水稻病毒病的方法,本研究利用两步法快速高效构建灰飞虱RNAi载体,并应用于水稻遗传转化。针对灰飞虱的激活性蛋白激酶C受体(RACK)基因设计了一对特异性引物,通过PCR扩增一段200 bp的干扰片段,将干扰片段克隆到入门载体p ENTR,再经过LR反应使入门载体上的干扰片段整合入目的载体p ANDA,形成RNAi载体p ANDA-RACK,通过农杆菌EHA105介导的水稻转化法转入武陵粳1号,获得20株经鉴定为阳性的转基因植株,为防控灰飞虱及其传播的水稻病毒病提供了珍贵材料。 相似文献
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OsMAPK17-1作为一种MAP激酶,受多种生物和非生物胁迫的诱导,且对病原菌的侵染有一定的防卫作用。为研究水稻OsMAPK17-1基因的功能,通过RT-PCR方法分离OsMAPK17-1基因全长cDNA,分别构建过表达与RNAi植物表达载体,采用农杆菌介导法以粳稻日本晴为受体进行遗传转化,PCR检测具有潮霉素抗性基因的转基因水稻植株,结果表明:OsMAPK17-1基因及RNAi片段均已整合到水稻基因组中。利用PCR和RT-PCR的方法对转基因后代进行筛选,获得过表达和RNAi转基因纯系各1个,模拟干旱处理结果表明,RNAi株系在干旱处理下比对照更有利于根的生长,这些结果为进一步研究OsMAPK17-1基因的功能奠定了基础。 相似文献
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精氨酸酶是氮素循环中催化精氨酸生成鸟氨酸和尿素的重要酶,可促进氮素的再利用,提高氮素的利用效率。依据Genbank(登陆号:HM369061.1)中水稻精氨酸酶的基因序列,应用RT-PCR方法同源克隆玉米自交系郑58中的精氨酸酶基因ZmArg。序列比对结果表明,克隆的ZmArg基因与GenBank中Zea mays PCO068984 mRNA(B73)序列相似度为99.9%;利用In-fusion技术构建该基因的植物过表达载体pCAMBIA5300-Ubi-ZmArg,导入农杆菌LBA4404用于玉米遗传转化,采用农杆菌侵染玉米芽尖方法转化早熟玉米自交系K10,获得T0代PCR阳性植株27株,其中18株收获种子;对T1代10个PCR阳性株系进行产量比较试验,4个株系百粒重和单株产量明显提高。 相似文献
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应用RNAi技术创制了花粉彻底败育的玉米雄性不育株系,为玉米杂交制种提供雄性不育的基础材料。构建玉米MS26 RNAi植物表达载体,其中,以玉米综31未成熟的幼胚组织为受体,利用农杆菌介导法将目的基因定向转入到玉米中,以甘露糖为选择剂进行筛选获得能够稳定遗传的转基因植株。通过Taqman探针法进行分子检测,获得18株单拷贝T0代转基因植株,碘-碘化钾染色分析结果显示,12株完全不育。在田间试验中,5个转化事件的所有T1代转基因植株在散粉期都表现雄性不育,且除此之外与野生型玉米对照植株之间没有其他形态不同。实时定量PCR结果显示,MS26 RNAi转基因玉米植株中MS26基因的表达量显著下调,由此可推断,MS26 RNAiT-DNA已经整合到玉米基因组中,并能引起完全的雄性不育。 相似文献
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甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。 相似文献
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AtCS25基因是拟南芥中一个功能未知的基因.生物信息学分析发现,该基因可能与花粉和花粉管的发育有关.为了进一步探究该基因的功能,克隆了AtCS25基因的全长CDS序列,并将克隆得到的片段插入到过表达载体pBI121相应的位置,构建了AtCS25基因的过表达载体pBI121 - AtCS25.通过农杆菌GV3101介导将该载体转入拟南芥Col生态型中,获得了5株转基因植株,为进一步研究AtCS25基因的功能奠定了良好的基础. 相似文献
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植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。 相似文献
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利用GATEWAYTM技术快速构建番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体 总被引:1,自引:0,他引:1
通过RT-PCR扩增番木瓜环斑PRsV病毒HC-pro基因,序列比对结果表明,克隆到的该基因片段与已知的海南或华南地区已克隆的HC-pro基因只有约92%的同源性,说明PRSV病毒具有较大的变异性.为了培育番木瓜转基因抗病植株,利用pWATERGATEI体和GATEWYTM技术,成功构建了番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体.具体步骤如下:①设计带特异性重组序列attB的HC-pro基因PCR的引物;②利用该引物进行RT-PCR扩增日C-pro基因;③通过BP反应,将扩增得到的HC-pro基因序列插入入门载体pDONR201中;④通过LR反应将HC-prd基因序列从pDONR201重组到目标载体pWATERGATE中,得到PRSV HC-pro基因的RNAi表达载体. 相似文献
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Bt基因表达载体的构建及对茶树遗传转化的研究 总被引:13,自引:5,他引:13
用限制性内切酶HindⅢ和BglⅡ从pGA4 71质粒中切取Bt基因并转入载体pCAMBIA2 30 1中 ,构建后的质粒含Bt基因、intron -GUS基因和NPTⅡ基因。将构建后的质粒转化大肠杆菌 ,通过三亲交配法分别导入农杆菌菌株LBA4 4 0 4、EHA10 5、pRi15834中。以茶树叶片、愈伤组织为转化的受体材料 ,用农杆菌介导法将其转入茶树中 ,获得了GUS瞬间表达。以潮霉素作为愈伤组织筛选的选择性试剂 ,效果明显优于卡那霉素 ,适宜浓度为 2 0 μ/ml;以卡那霉素作为茶树叶片材料的筛选试剂 ,50 μ/ml为宜。 相似文献